不同小麦秸秆还田覆盖度对旱作农田土壤微生物群落多样性的影响

2021-03-25张婷婷王丽芳张德健路战远程玉臣刘战勇敦惠霞

北方农业学报 2021年1期

张婷婷，王丽芳，张德健，路战远，程玉臣，李福，刘战勇，敦惠霞

（1.牧草与特色作物生物技术教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特 010070；2.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010070；3.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031）

我国作为农业大国，每年产生9 亿多t 秸秆，秸秆可用于还田、加工饲料等。但目前，许多农户将秸秆直接焚烧，不仅会造成环境污染，还可能会引发火灾。因此，秸秆利用是一个值得关注的农业问题。将秸秆直接还田是目前利用秸秆资源最简单有效的方式。秸秆还田可以改善土壤结构，而且由于秸秆中含有大量的碳、氮、磷、钾等营养元素[1-2]，因此，可以提高土壤肥力[3-6]，使作物增产增收[7-8]。此外，秸秆还田有利于土壤微生物的生长繁殖。土壤微生物作为生态环境的重要组成部分，不仅参与土壤物质循环和能量流动，还是土壤的重要组成部分，是反映土壤质量的重要指标之一[9-11]。目前，关于秸秆还田对微生物群落结构影响的研究表明，对于不同的耕作方式而言，短时间内免耕与翻耕相比，免耕会暂时降低土壤微生物的物种丰富度[12]，但长时间的免耕会显著提高土壤微生物丰富度和代谢功能[13-16]；对于不同的秸秆还田方式及肥料管理来说，无论是秸秆覆盖还是秸秆翻埋，合理配施氮、磷、钾肥料均能有效提高土壤中细菌、真菌的多样性[17]，配施有机肥的土地中土壤质量和微生物丰富度、多样性也有明显提高[18]，当然秸秆还田时有机肥和无机肥配施也能提高土壤微生物数量[19-21]，且更靠近秸秆表层的土壤微生物数量明显高于下层[22]；对于作物生长的时期而言，秸秆还田之后在作物生长的各个时期土壤微生物代谢功能都有显著提高[23]；对于不同的还田物料而言，选择合适的作物秸秆进行还田也能显著提高土壤微生物多样性[24-25]。此外，水分管理方式不同、土地利用方式不同、土壤类型不同都会对微生物的群落产生一定影响[26-28]。前人的各种试验结论虽然侧重方向不同，但均表明合理的秸秆还田技术能够提高土壤微生物群落的各方面指数。由此可知，在生产实践中，探究更适合旱作农业区土壤的秸秆还田方式十分重要。

土壤中微生物数量巨大、种类繁多，传统的琼脂培养基培养对于研究土壤微生物的群落多样性并不适用。其他用于研究微生物多样性的分子生物学技术中Biolog 平板法是测试活菌的代谢特性，试验过程中必须确保菌株的存活；磷脂脂肪酸（PLFA）图谱分析法，微生物在不同条件下磷脂脂肪酸的含量不同，会导致数据不准确；变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术，因为只显示群落中的优势物种可能导致自然群落中细菌数量估计不准确；此外还有TGGE、TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH 等方法，而这些方法都存在操作繁琐，无法准确、全面地研究土壤微生物群落多样性等缺点。与以上技术相比，高通量测序技术测定环境中的总DNA 并不需要对微生物进行分离和纯化，能够更准确地研究土壤中微生物以及低成本、高通量、流程自动化等优点，为认识和利用未培养微生物提供了新的途径。

本试验研究了内蒙古地区旱作农业区不同小麦秸秆还田覆盖度对土壤微生物群落多样性的影响，并对土壤微生物群落使用高通量测序进行测定，旨在从实践中探讨出最适合该地区的秸秆还田量，为内蒙古地区秸秆还田技术的改进提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验于2018年在内蒙古武川县境内，地处北纬40°47′～41°23′，东经110°31′～111°53′，属中温带大陆型季风气候。该地区是典型的旱作农业，也是北方农牧交错带典型代表区域。土壤以栗钙土为主，0～20 cm表层土碱解氮的平均含量为86.00 mg/kg、速效磷平均含量为7.00 mg/kg、速效钾含量平均为150.00 mg/kg、有机质平均含量为1.72%、pH值8.54。无霜期124 d，年平均积温为2 578.5℃，平均降水量为354.1 mm。试验田已经进行了5年的先期秸秆还田处理。

1.2 试验设计与田间管理

试验共设5个处理，分别为秸秆无覆盖度、秸秆覆盖度30%、秸秆覆盖度50%、秸秆覆盖度70%、秸秆覆盖度90%，每个处理重复设置3次，共15个小区，小区面积为220 m2，各小区以自然田埂分隔，小区随机排列。在小麦收割的时候使用收割机将秸秆就地粉碎排出，使用打捆机将地表部分秸秆进行回收，使剩余秸秆覆盖度分别达到0、30%、50%、70%、90%，然后进行翻耕，以此实现秸秆直接还田。

试验供试材料为内蒙古自治区农牧业科学院选育的小麦品种——农麦2号。小麦行距20 cm，磷酸二铵120 kg/hm2、尿素30 kg/hm2做种肥，其他水分管理、除草、病虫害防治等管理措施参照当地常规大田生产。

1.3 测定指标及方法

分别在小麦拔节期和开花期用土钻取0～20 cm土层的土壤，采用5 点取样法进行取样，将每个点中的土样混合在一起，去除植物残体、根系及可见土壤动物。采用试剂盒提取法测定土样微生物DNA，将样品送至上海派森诺生物公司进行高通量测序，并进行土壤微生物数量、种类及多样性的测定。

拔节期无秸秆覆盖、秸秆覆盖度30%、秸秆覆盖度50%、秸秆覆盖度70%、秸秆覆盖度90%，分别用X1B、X2B、X3B、X4B、X5B表示，开花期无秸秆覆盖、秸秆覆盖度30%、秸秆覆盖度50%、秸秆覆盖度70%、秸秆覆盖度90%，分别用X1K、X2K、X3K、X4K、X5K表示。

细菌使用Illumina MiSeq 平台进行16S 测序，测序区域为rDNA的V4 区，使用Greengene 注释数据库进行比对。真菌使用454 FLX+平台进行ITS 测序，使用Unite 注释数据库进行比对。

对于测序后的数据，使用Qiime 进行数据过滤和数据质控，细菌质控质量值为Q20，真菌质控质量值为Q25。均使用双末端测序，使用Qiime 将两条reads 进行连接。将得到的有效序列对照物种数据库进行注释，再使用mothur 去除嵌合体。获取的序列进行操作分类单元（OTU）的聚类，使用Qiime 在97%相似度下聚类，然后生成稀释曲线、Venn 图、多样品物种分布图。使用mothur 计算出生物多样性指数各分类学水平样品物种丰富度统计。使用R 软件绘制主成分分析图和聚类分析热图。

2 结果与分析

2.1 序列聚类分析

不同秸秆覆盖还田处理的土壤样品微生物的序列统计结果见表1。由表1可以看出，不同秸秆覆盖还田处理下拔节期土壤真菌有效序列的大小顺序为覆盖度50%＞覆盖度70%＞无覆盖＞覆盖度30%＞覆盖度90%。优质序列占比除无覆盖、覆盖度70%为76.82%、81.98%外，覆盖度30%、覆盖度50%、覆盖度90%在86.56%～89.60%，平均达到84.48%；不同秸秆覆盖还田处理下开花期土壤真菌有效序列的大小顺序为覆盖度70%＞覆盖度50%＞覆盖度30%＞无覆盖。开花期真菌优质序列占比除覆盖度30%、覆盖度50%为83.46%、83.39%外，无覆盖和覆盖度70%为90.49%、88.60%。不同秸秆覆盖还田处理下拔节期土壤细菌有效序列的大小顺序为覆盖度70%＞覆盖度30%＞无覆盖＞覆盖度90%＞覆盖度50%。拔节期细菌优质序列占比除覆盖度70%为82.96%外，无覆盖、覆盖度30%、覆盖度50%、覆盖度70%、覆盖度90%在92.89%～93.60%，平均达到93.27%；不同秸秆覆盖还田处理下开花期土壤细菌有效序列的大小顺序为覆盖度30%＞覆盖度70%＞覆盖度50%＞无覆盖。开花期细菌优质序列占比在93.15%～93.65%，平均达到93.44%。

表1 样本序列数据统计

使用操作分类单元（OTU）的Venn 统计多个样品中独有和共有的OTUs 数目，通过图1可以直观反映环境样品的OTUs 重叠情况。

真菌OTUS 聚类情况（图1），拔节期所有样品的2 827个分类单元中真菌OTUs 共有数目为137个，占每个处理土壤样品总OTUs的18%～28%。每个样品中各自特有的OTUs 占其自身比例均在26%以上，比例最高的是X1B，占自身比例的47%，其次是X4B、X3B、X2B、X5B。开花期2 532个分类单元中有130个是所有样品共有的，占每个样品的20%～30%。每个样品中各自特有的OTUs 占其自身比例大都在22%以上，比例最高的为X3K，占自身比例的39%，其次是X4K、X5K、X2K、X1K。真菌各个样品中独有和共有的OTUs 均在20%以上，OTUs 重合度和物种的相似度较低。表明样品中真菌群落对秸秆还田的响应相对较差。

图1 小麦拔节期和开花期的土壤真菌OTUs 分布Venn

细菌聚类情况（图2），拔节期细菌22 978个OTUs中有2 884个是所有样品共有的，占每个样品的59%～69%。每个样品中各自特有的OTUs 占其自身比例均不足1%，最高的是X3B，其次是X4B、X2B、X1B、X5B。开花期细菌22 095个OTUs中有2 670个是所有样品共有的，占每个样品的56%～68%。除X2K 以外，每个样品中各自特有的OTUs 占其自身比例均不足1%。细菌各个样品中OTUs 重叠性较高，物种的种类大致相同。

2.2 物种丰富度分析

2.2.1 稀释曲线稀释曲线（rarefaction curve）是通过抽取序列，从抽取到的序列中看其所能代表的OTUs的数量，表明样本的取样大小是否合理；如果测序数量不同，也可以使用稀释曲线表示样本物种的丰富度。

图3和图4中稀释曲线基本趋于平缓，表明本抽取序列代表的OTUs 覆盖度已经饱和，样品中绝大多数微生物已经包含在数据库中。本研究的数据能够比较真实、准确地反映样品中的微生物群落组成情况。

图2 小麦拔节期和开花期的土壤细菌OTUs 分布Venn

图3 真菌稀释曲线

图4 细菌稀释曲线

2.2.2 物种丰富度分析由表2中ACE指数和Chao指数估计物种总数，以代表物种丰富度，ACE或Chao指数越大，表明群落丰富度越高。真菌的丰富度从ACE指数来看大小顺序为X1B＞X3K＞X4B＞X2B＞X3B＞X4K＞X5B＞X5K＞X1K＞X2K，最高的为X1B（拔节期无覆盖）1 450.16，其次为X3K（开花期覆盖度50%）1 201.79；从Chao指数来看大小顺序为X1B＞X3K＞X4B＞X3B＞X4K＞X2B＞X5B＞X5K＞X1K＞X2K，最高为X1B（拔节期无覆盖）的1 230.00，其次为X3K（开花期覆盖度50%）1 019.68。细菌的丰富度从ACE指数来看大小顺序为X2B＞X3B＞X3K＞X2K＞X5B＞X4K＞X1K＞X5K＞X4B＞X1B，最高为X2B（拔节期覆盖度30%）的5 314.22，其次为X3B（拔节期覆盖度50%）5 286.29；从Chao指数来看大小顺序为X2B＞X3K＞X2K＞X3B＞X4K＞X5B＞X4B＞X1K＞X5K＞X1B，最高为X2B（拔节期覆盖度30%）的5 333.27，其次为X3K（开花期覆盖度50%）5 308.82。因此，真菌丰富度指数在无覆盖度和覆盖度50%时最高，细菌丰富度指数在覆盖度30%和50%时最高。

2.3 Alpha 多样性分析

Alpha 多样性是描述同一个生态环境中各个物种共存状态的量，用于研究样本内物种的多样性。Shannon-Wiener指数和Simpson指数用于表示物种多样性，Shannon-Wiener值越大，表明群落多样性越高；Simpson指数越大，表明群落多样性越低。由表2可知，真菌群落多样性从Shannon-Wiener指数来看，大小顺序为X5B＞4K＞X5K＞X2K＞X1B＞X1K＞X2B＞X3K＞X4B＞X3B，最高为X5B（拔节期覆盖度90%）的4.587 9，其次是X4K（开花期覆盖度70%）的4.581 2；从Simpson指数来看，大小顺序为X4K＞X5B＞X5K＞X2K＞X1K＞X3K＞X1B＞X2B＞X4B＞X3B，最高为X4K（开花期覆盖度70%）的0.023 9，其次是X5B（拔节期覆盖度90%）的0.032 0。细菌群落多样性从Shannon-Wiener指数来看，大小顺序为X2K＞X3B＞X3K＞X2B＞X4B＞X1K＞X5B＞X4K＞X5K＞X1B，最高为X2K（开花期覆盖度30%）的7.013 8，其次是X3B（拔节期覆盖度50%）的6.953 4；从Simpson指数来看，大小顺序为X2K＞X3B＞X1K=X2B=X3K＞X4B＞X5K＞X5B=X4K＞X1B，最高为X2K（开花期覆盖度30%）的0.002 6，其次是X3B（拔节期覆盖度50%）的0.002 7。真菌多样性指数在覆盖度70%和90%时最高，细菌多样性指数在覆盖度30%和50%时最高。

表2 群落丰富度指数与多样性指数

2.4 群落结构分析

2.4.1 群落组成分析群落组成结构分析是以百分比柱状图的形式展示多个样品中各分类水平上生物的组成比例情况。

由图5可知，真菌中占优势的主要有子囊菌门（Ascomycotina）、担子菌门（Basidiomycotina）、接合菌门（Zygomycotina）。其中，子囊菌门在各处理各生育时期均占优势，X2B、X2K（覆盖度30%）的子囊菌门（Ascomycotina）占比最大，无覆盖样品中子囊菌门（Ascomycotina）所占比例为所有样品中最小。无覆盖（X1B、X1K），覆盖度30%（X2B、X2K），覆盖度90%（X5B、X5K）时，子囊菌门（Ascomycotina）在两个时期的占比都比较稳定，其余样品都是开花期比拔节期所占比例略微提高。秸秆覆盖能明显提高优势菌种的占比，覆盖度为30%时能使真菌优势菌种维持在较高水平，覆盖度为50%和70%时，随着时间推移能明显提高优势菌种的占比。

图5 真菌群落结构组成

图6中细菌中占优势的主要有疣微菌门（Verrucomicrobia）、变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）。其中，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）在各处理各生育时期均占优势。变形菌门（Proteobacteria）无覆盖情况下开花期所占比例会相对减少，覆盖度30%（X2B、X2K）时占比变化不大，覆盖度50%以上开花期比拔节期占比会略微提高；放线菌门（Actinobacteria）各个覆盖度中开花期占比都比拔节期略微下降；酸杆菌门（Acidobacteria）除覆盖度为30%（X2B、X2K）的样品外，其余都是开花期占比相对于拔节期高。随着时间的推移，优势菌种占比有升有降，秸秆覆盖更有利于提高细菌群落的均匀度。

图6 细菌群落结构组成

2.4.2 主成分分析主成分分析（PCA）是将数据进行方差分解之后，把差异归纳到一张坐标图上，横纵两个坐标轴表示该成分对于不同样品的影响，用各点之间的距离表示样品的差异，距离越近说明两个样品的微生物群落差异越小。

由图7可知，真菌X1K（开花期无覆盖）和X2K（开花期覆盖度30%）的真菌群落差异最小，与X1K、X2K 差异最大的是X3K（开花期覆盖度50%）；所有样品中差异最大的是X3K（开花期覆盖度50%）和X3B（拔节期覆盖度50%）。秸秆覆盖度为50%时，随着时间推移群落组成变化较大，群落多样性更高。细菌距离最近的是X1K（开花期无覆盖）和X4K（开花期覆盖度70%），距离最远的是X1B（拔节期无覆盖）和X2K（开花期覆盖度30%）。更重要的是X2B（拔节期覆盖度30%）和X2K（开花期覆盖度30%）的群落差别并不大，X3B（拔节期覆盖度50%）和X3K（开花期覆盖度50%）的差别也不大。覆盖度为30%和50%时细菌的群落差异不大，群落结构相对稳定。

2.4.3 聚类分析热图聚类分析热图（heatmap）是将表格数据使用更直观的色块表示，用颜色深浅表示丰富度的大小，并表示各个样品差异大小。

图8中真菌群落结构最相近的是X3K（开花期覆盖度50%）和X4B（拔节期覆盖度70%），并且X3K（开花期覆盖度50%）与X3B（拔节期覆盖度50%）差异较大。与PCA分析一致证明覆盖度为50%时真菌群落组成差异较大。

图9中细菌群落最相近的是覆盖度为30%的时（X2B、X2K）和X3B（拔节期覆盖度50%），其次是X4K（开花期覆盖度70%）和X5K（开花期覆盖度90%）。与PCA分析一致证明覆盖度为30%和50%时群落结构比较稳定。

图7 主成分分析

3 讨论

前人研究已经证明，秸秆还田会对土壤微生物产生积极影响，会提高微生物群落丰富度和土壤微生物代谢能力等[29]。秸秆含有丰富的营养物质，秸秆还田之后可以为土壤微生物提供丰富的营养物质，供其生长发育，增加了土壤微生物的多样性[30]。

由本试验中操作分类单元（Venn 图1、图2）可知，各样品中细菌群落共有的OTUs种类占自身比例较大，特有的OTUs种类较少；各样品中真菌群落特有的OTUs种类占自身比例较多，共有的OTUs种类较少。

本试验单个样品群落内的丰富度分析中，对于丰富度指数的分析表明秸秆覆盖度为50%时能让真菌和细菌的丰富度维持在较高水平。对于覆盖度超过某一程度之后微生物群落丰富度反而会下降的原因，前人有研究表明，虽然秸秆还田会为土壤提供营养物质支持植物和微生物生长，但是秸秆中含碳较多，秸秆还田会使土壤碳氮比升高，如果土壤中没有足够的氮，会导致植物和细菌出现“争氮”的现象，从而限制微生物的生长发育，会导致微生物群落丰富度下降[31-34]。