PYCR1在胃癌细胞中的表达及生物学功能研究

孙娟　林晖　王耀新　蔡惠美　唐晶晶

【摘要】 目的：研究與分析PYCR1在胃癌细胞中的表达及生物学功能。方法：选取2017年10月-

2020年1月本院32例胃癌患者为观察组，同时期的32例胃炎患者为对照组。比较两组的病灶组织PYCR1表达情况，并比较观察组中不同疾病分期及淋巴结转移情况者的PYCR1表达情况，采用Spearman秩相关分析其与疾病分期及淋巴结转移情况的关系;取胃癌AGS、SGC-790及MGC-803细胞分别分为si-NC组（转染对照质粒）与si-PYCR1组（转染敲低序列PYCR1质粒），比较各组的细胞克隆数、凋亡细胞率及细胞穿膜数。结果：观察组的PYCR1表达水平高于对照组（P<0.05）。观察组中不同疾病分期及淋巴结转移情况者的PYCR1表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05），Spearman秩相关分析显示，PYCR1与疾病分期及淋巴结转移情况均呈正相关（rs=0.910、0.881，P<0.05）。AGS、SGC-790及MGC-803细胞的si-PYCR1组的细胞克隆数及细胞穿膜数均低于si-NC组，凋亡细胞率均高于si-NC组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：PYCR1在胃癌细胞中呈现高表达，且与疾病分期及淋巴结转移情况均呈正相关，干扰PYCR1可有效控制胃癌细胞增殖及迁移侵袭。

【关键词】 PYCR1 胃癌细胞 增殖 迁移 侵袭

Study on the Expression of PYCR1 in Gastric Cancer Cells and Biological Function/SUN Juan， LIN Hui， WANG Yaoxin， CAI Huimei， TANG Jingjing. //Medical Innovation of China， 2021， 18（23）： -166

[Abstract] Objective： To study and analyze the expression and biological function of PYCR1 in gastric cancer cells. Method： From October 2017 to January 2020， 32 patients with gastric cancer in our hospital were selected as the observation group， and 32 patients with gastritis during the same period were selected as the control group. The expression of PYCR1 in the two groups was compared， and the expressions of PYCR1 in patients with different disease stages and lymph node metastasis in the observation group were compared. The relationship between PYCR1 and disease stage and lymph node metastasis was analyzed by Spearman rank correlation. Gastric cancer AGS， SGC-790 and MGC-803 cells were divided into si-NC group （transfected control plasmid） and si-PYCR1 group （transfected knockdown sequence PYCR1 plasmid）， respectively. The number of cell clones， apoptotic cell rate and cell transmembrane number were compared in each group. Result： The expression level of PYCR1 in the observation group was higher than that in the control group （P<0.05）. The differences of PYCR1 expression levels in patients with different disease stages and lymph node metastasis in the observation group were statistically significant （P<0.05）. Spearman rank correlation analysis showed that， PYCR1 was positively correlated with disease stage and lymph node metastasis （rs=0.910， 0.881， P<0.05）. The number of cell clones and cell transmembrane number in si-PYCR1 group of AGS， SGC-790 and MGC-803 cells were lower than those in si-NC group， and the rates of apoptotic cells were higher than those in si-NC group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： PYCR1 is highly expressed in gastric cancer cells and is positively correlated with disease stage and lymph node metastasis， interfering with PYCR1 can effectively control the proliferation， migration and invasion of gastric cancer cells.

[Key words] PYCR1 Gastric cancer cells Proliferation Migration Invasion

First-author’s address： Fuzhou First Hospital， Fuzhou 350009， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.23.040

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤，与胃癌相关的各方面研究一直是临床重点。与胃癌预后相关的研究中，胃癌细胞的增殖侵袭及转移能力是重要因素[1-2]。PYCR1作为在多类恶性肿瘤患者中研究较多的指标，较多研究认为其对于肿瘤细胞的增殖及侵袭转移具有促进作用[3-5]。临床中关于PYCR1在胃癌细胞中的作用机制，尤其是生物学功能的研究极为匮乏，且在细致程度方面有所欠缺，因此本方面的研究意义较高。本研究就PYCR1在胃癌细胞中的表达及生物学功能进行研究与分析，以为疾病的诊治与控制提供参考依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）组织标本来源。选取本院2017年10月-2020年1月收治的32例胃癌患者为观察组，另选取同时期32例胃炎患者为对照组。纳入标准：20～75岁者;男女不限;观察组为确诊为胃癌者，对照组为确诊为胃炎者。排除标准：合并其他消化系统疾病者;合并创伤者;妊娠期及哺乳期者;合并慢性基础疾病者;合并代谢性疾病者。患者均对研究知情同意。（2）胃癌细胞。胃癌AGS、SGC-790及MGC-803细胞均来源于中国科学院。（3）试剂。基础培养基和胎牛血清（Biological Industries，美国），酶标仪（Invitrogen公司，美国），CCK-8细胞计数检测试剂盒（CST，美国），兔抗人-PYCR1抗体、HRP抗兔二抗（北京博奥森生物公司），Transwell小室（Corning公司），Trizol试剂（Ta Ka Ra公司），CCK8试剂（同仁公司），Matrigel基质胶（BD公司）。本研究已经伦理学委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 对照组和观察组PYCR1表达情况 采集两组病灶组织标本，将组织标本进行常规处理，采用RT-qPCR法进行其相对表达量的检测，首先进行总RNA的提取，然后进行2-ΔΔCt的方法进行相对表达量的计算，比较两组的病灶组织PYCR1表达情况，并比较观察组中不同疾病分期及淋巴结转移情况者的PYCR1表达情况，采用Spearman秩相关分析其与疾病分期及淋巴结转移情况的关系。

1.2.2 胃癌细胞分组与培养 将胃癌AGS、SGC-790及MGC-803细胞株置于添加青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL的含15%胎牛血清DMEM培养液中培养。选取对数生长期细胞胰酶消化后，用基础培养基调整细胞密度为1×106个/mL，

将细胞接种到6孔板后37 ℃孵育24 h。按照制造商说明书用Lipofectamine TM 2000将三种胃癌细胞分别转染三种敲减序列PYCR1质粒（5’-TGAGAAGAAGCTGTCAGCGTT-3’;5’-TCAGAGCTGAAAGTGGACGT-3’;5’-TAGAACCTATGAAGGAAGGTT-3’），利用RT-qPCR和免疫印迹试验检测PYCR1表达，选取干扰效率最高的细胞株进行后续试验，命名為si-PYCR1组;另取三种胃癌细胞转染对照质粒siRNA-NC作为si-NC组。

1.2.3 克隆形成实验 转染48 h后取AGS、SGC-790及MGC-803细胞si-NC组与si-PYCR1组的对数生长周期的细胞，以胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，将其悬浮于10%胎牛血清的培养液中，细胞悬液进行梯度倍数稀释，以梯度密度接种于37 ℃培养皿中，与5% CO2下培养2～3周，形成肉眼可见的克隆后，采用PBS浸洗，处理2次，采用多聚甲醛进行固定，染色，流水洗去染色，进行干燥处理后采用制成透明胶片，低倍镜下进行克隆数的计数。实验重复5次。

1.2.4 AnnexinV/PI双染色细胞凋亡试验 收集各组细胞，调整待检测细胞浓度，预冷PBS进行两次润洗，4 ℃条件下3 000 r/min，离心5 min，将细胞重悬与Binding Buffer，加入Annexin-FITC并混匀，避光条件下置于冰上，15 min后将其转至流式检测管，加入PBS，再加入PI后上机检测，另以不加Annexin-FITC及PI的作为阴性对照。分别加Annexin-FITC及PI作为横轴与纵轴进行结果分析，统计分析凋亡细胞率。实验重复5次。

1.2.5 Transwell细胞侵袭实验 将基质胶提前放置在4 ℃冰箱内融化，以1︰8 的比例将其与不含血清的Matrigel基质胶混匀，将混合液每个小室加入100 μL后放入37 ℃孵箱内24 h。各组细胞消化离心，使用无血清的Matrigel基质胶重悬细胞计数，调整细胞密度为3×108个/L。将Transwell小室置入24孔板内，在小室上室加入200 μL细胞悬液，下室加入700 μL含血清的完全培养基。细胞孵箱内正常培养24 h后取出小室，PBS轻轻洗涤后，用棉签擦去小室内侧细胞。4%多聚甲醛固定20 min后晾干，再用0.1%结晶紫染色15 min 后，PBS清洗小室2～3次后自然风干，最后显微镜观察穿膜细胞并拍照，保存后使用软件计数。实验重复5次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，重复测量的计量资料进行方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用χ检验;因素之间的关系采用Spearman秩相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 对照组男20例，女12例;年龄29～75岁，平均（65.3±6.9）岁，其中浅表性胃炎2例，糜烂性胃炎10例。观察组男19例，女13例;年龄30～76岁，平均（65.7±7.0）岁;疾病分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例;淋巴结转移情况：无转移12例，近处转移11例，远处转移9例。两组年龄与性别比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 两组PYCR1表达情况比较 观察组的PYCR1表达量为（3.63±0.56）高于对照组（1.21±0.21），差异有统计学意义（t=22.889，P=0.000）。

2.3 观察组中不同疾病分期及淋巴结转移者的PYCR1表达情况比较 观察组中不同疾病分期及淋巴结转移情况者的PYCR1表达比较，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。Spearman秩相关分析显示，PYCR1与疾病分期及淋巴结转移情况呈正相关（rs=0.910、0.881，P<0.05）。

2.4 胃癌AGS、SGC-790及MGC-803细胞经不同转染后细胞克隆数、凋亡细胞率、细胞穿膜数比

较 AGS、SGC-790及MGC-803细胞si-PYCR1组的细胞克隆数及细胞穿膜数均低于si-NC组，凋亡细胞率高于si-NC組，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

胃癌是临床研究的重点，与之相关临床研究较多，且涉及面较广，其中与肿瘤细胞增殖、侵袭转移等方面的研究是重中之重。临床中与肿瘤细胞相关信号通路及增殖、凋亡调控相关的基因研究涉及种类较多[6-9]。PYCR1在前列腺癌、乳腺癌等多类恶性肿瘤中的研究可见，其主要为通过影响脯氨酸代谢来达到影响肿瘤细胞增殖的目的，在多类恶性肿瘤细胞中都呈现出相对较高的表达状态[10-14]。近年来关于PYCR1在恶性肿瘤中的表达研究不断增多，其中可见在结肠癌等消化系统恶性肿瘤的表达变化研究，但是其在胃癌患者中的表达仍有待探究[15-18]。

本研究结果显示，观察组的PYCR1表达水平高于对照组（P<0.05）;观察组中不同疾病分期及淋巴结转移情况者的PYCR1表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;Spearman秩相关分析显示，PYCR1与疾病分期及淋巴结转移情况均呈正相关（rs=0.910、0.881，P<0.05），肯定了PYCR1在胃癌患者中的检测价值及其与胃癌疾病分期、淋巴结转移的相关性。AGS、SGC-790及MGC-803细胞的si-PYCR1组细胞克隆数及细胞穿膜数均低于si-NC组，凋亡细胞率均高于si-NC组（P<0.0.5），进一步肯定了PYCR1表达对于胃癌肿瘤细胞的增殖、侵袭等方面的影响。PYCR1在脯氨酸代谢过程中，极大地影响到氧自由基的代谢，进而通过影响钙调磷酸激酶途径来达到影响肿瘤细胞增殖的目的[17-20]。

综上所述，PYCR1在胃癌细胞中呈现高表达，且与疾病分期及淋巴结转移情况均呈正相关，干扰PYCR1可有效控制其增殖及迁移侵袭。

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（收稿日期：2020-09-30） （本文编辑：田婧）