维生素D联合二甲双胍对PCOS-IR患者子宫内膜容受性及GLUT4表达的影响

万娜　张广清　刘艳红　王珍芳

【摘要】 目的：研究維生素D联合二甲双胍对PCOS-IR患者子宫内膜容受性及GLUT4表达的影响。方法：选取2019年1-10月于本院就诊的162例PCOS-IR患者，根据掷硬币法将PCOS-IR患者随机分为对照组（n=80）和研究组（n=82）。对照组患者采用二甲双胍治疗，研究组在对照组的基础上加用维生素D。比较两组治疗前后的子宫内膜容受性（内膜厚度、内膜容积、内膜螺旋动脉RI和PI、子宫Vmean和Vmax、子宫动脉RI和PI、子宫内膜多层率、内膜分型、Salle评分）及GLUT4和αvβ3表达情况。结果：治疗前，两组内膜厚度、内膜容积、内膜螺旋动脉RI、内膜螺旋动脉PI、子宫动脉Vmean、Vmax、子宫动脉PI、子宫动脉RI和子宫内膜多层率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗后，两组内膜厚度、内膜容积均高于治疗前，内膜螺旋动脉RI和PI、子宫动脉PI和RI、子宫内膜多层率均低于治疗前，差异均有统计学意义（P<0.05）;治疗后，两组子宫动脉Vmean和Vmax均高于治疗前，且研究组均高于对照组，差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗后，研究组患者内膜厚度、内膜容积均高于对照组，内膜螺旋动脉RI和PI、子宫动脉PI和RI、子宫内膜多层率均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗前，两组内膜分型比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，研究组内膜分型优于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗前，两组Salle评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，两组Salle评分均高于治疗前，且研究组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗前，两组GLUT4和αvβ3表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗后，两组GLUT4和αvβ3均高于治疗前，且研究组均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：对PCOS-IR患者进行维生素D联合二甲双胍治疗，可改善子宫内膜容受性超声指标，增加子宫动脉血流，从生物活性分子水平上改善内膜容受性。

【关键词】 多囊卵巢综合征 胰岛素抵抗 内膜容受性 二甲双胍 GLUT4

Effects of Vitamin D Combined with Metformin on Endometrial Receptivity and GLUT4 Expression in PCOS-IR/WAN Na， ZHANG Guangqing， LIU Yanhong， WANG Zhenfang. //Medical Innovation of China， 2021， 18（23）： 0-081

[Abstract] Objective： To study the effects of Vitamin D combined with Metformin on endometrial receptivity and GLUT4 expression in PCOS-IR. Method： A total of 162 patients with PCOS-IR admitted to our hospital from January to October 2019 were selected， they were randomly divided into control group （n=80） and study group （n=82） according to coin toss method. The control group was treated with Metformin， and the study group was treated with Vitamin D on the basis of the control group. The endometrial receptivity （intimal thickness， intimal volume， intimal spiral artery RI and PI， uterine artery Vmean and Vmax， uterine artery RI and PI， endometrial multilayer rate， endometrial classification， Salle scores） and the expression of GLUT4 and αvβ3 before and after treatment were compared between two groups. Result： Before treatment， there were no significant differences in intimal thickness， intimal volume， intimal spiral artery RI and PI， uterine artery Vmean and Vmax， uterine artery RI and PI， endometrial multilayer rate between two groups （P>0.05）; after treatment， intimal thickness， intimal volume of two groups were higher than those before treatment， intimal spiral artery RI and PI， uterine artery PI and RI， endometrial multilayer rate were lower than those before treatment， the differences were statistically significant （P<0.05）; after treatment， the uterine artery Vmean and Vmax of two groups were higher than those before treatment， and those of the study group were higher than those of the control group， the differences were not statistically significant （P>0.05）; after treatment， intimal thickness and intimal volume of the study group were higher than those of the control group， intimal spiral artery RI and PI， uterine artery PI and RI， endometrial multilayer rate were lower than those of the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Before treatment， there were no statistically significant differences in the endometrial classification between two groups （P>0.05）; after treatment， the endometrial classification of the study group was superior than that of the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Before treatment， there was no significant difference in Salle scores between two groups （P>0.05）; after treatment， Salle scores of two groups were higher than those before treatment， and that of the study group was higher than that of the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Before treatment， there were no significant differences in GLUT4 and αvβ3 expression between two groups （P>0.05）; after treatment， GLUT4 and αvβ3 of two groups were higher than those before treatment， and that of the study group was higher than that of the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Vitamin D combined with Metformin in the treatment of PCOS-IR can improve endometrial receptivity ultrasound variables， increase uterine artery blood flow， improve endometrial receptivity at the level of bioactive molecules.

[Key words] Polycystic ovarian syndrome Insulin resistance Endometrial receptivity Metformin GLUT4

First-author’s address： Maternal and Child Health Hospital of Qingyuan City， Qingyuan 511500， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.23.019

作为育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育龄妇女不孕的主要原因[1]。PCOS患者存在代谢紊乱、生育功能异常和内分泌异常。PCOS病理生理的中心环节是高胰岛素血症和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）。二甲双胍（Metformin）是一种胰岛素增敏剂，是治疗PCOS-IR的常用药物。因PCOS主要是排卵障碍引起的不孕，因此其主要治疗手段是诱发排卵，但存在排卵率高、妊娠率低的问题，这可能是由于PCOS存在代谢异常导致子宫内膜的功能和代谢紊乱，造成子宫内膜容受性低下，降低了妊娠率[2]。以往研究发现，PCOS患者普遍存在维生素D缺乏，而PCOS代谢紊乱和内分泌紊乱与维生素D缺乏相关[3]。

足够量的葡萄糖代谢参与了子宫内膜细胞的成熟和分化，葡萄糖转运蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT4）作为载体可转运胰岛素介导的葡萄糖，GLUT4可能与PCOS-IR的内膜容受性有关[4]。二甲双胍可以提高胰岛素敏感性，降低胰岛素水平，但是否能改善GLUT4表达，能否改善内膜容受性在超声学的指标，尚无相关研究做出明确阐述，本研究对维生素D联合二甲双胍对PCOS子宫内膜容受性及GLUT4的表达，以期为临床治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1-10月于本院就诊的162例PCOS-IR患者。纳入标准：（1）符合《多囊卵巢综合征的诊断标准》，①无排卵或稀发排卵;②卵巢多囊样改变;③高雄激素血症或临床表现为雄激素水平升高，符合其中2条即诊断为多囊卵巢综合征[5]。（2）符合胰岛素抵抗标准，①胰岛素释放试验中，空腹胰岛素水平高于正常值上限15 mIU/L;②口服葡萄糖耐量试验，血糖值在2 h时>7.8 mmol/L，以及C肽和2 h胰岛素无下降表现或持续升高[5]。（3）20～40岁。（4）神志正常。排除标准：（1）合并甲状腺功能异常、下丘脑性闭经、垂体性闭经、卵巢早衰及高泌乳素血症等引起排卵障碍的疾病。（2）合并分泌雄激素的肿瘤、库欣（Cushing）综合征、先天性肾上腺皮质增生等导致雄激素水平升高的疾病。（3）合并心、肺、肾等重要脏器的器质性病变。（4）入组前3个月内进行心脏、肾脏手术。按掷硬币法将PCOS-IR患者随机分为对照组（n=80）和研究组（n=82）。本研究已经伦理学委员会批准，所有患者均告知试验目的及方法，并签署知情同意书。

1.2 方法 对照组：给予盐酸二甲双胍片（生产厂家：北京四环制药有限公司，批准文号：国药准字H11020127，规格：0.25 g）口服，50 mg/次，3次/d，一个疗程为4周。研究组：在对照组基础上给予口服维生素D（生产厂家：上海新华联制药有限公司，批准文号：国药准字H31020081，规格：400 IU/粒）治疗，1 200 IU/次，1次/d，一个疗程为4周。两组均治疗3个疗程。

1.3 观察指标与判定标准 （1）比较两组治疗前后的内膜厚度、内膜容积、内膜螺旋动脉RI、内膜螺旋动脉PI、子宫动脉Vmean、子宫动脉Vmax、子宫动脉RI、子宫动脉PI和子宫内膜多层率。所有患者均进行超声监测，从月经周期第10天进行阴道超声监测，成熟卵泡为卵泡平均直径≥18 mm。排卵的一般表现：卵泡壁界限模糊;卵泡内部透声差，增大的卵泡突然消失或变小;子宫后方直肠陷凹有积液。在卵泡成熟时，患者取膀胱截石位，将一次性避孕套套在陰道探头上，设备为美国GE-S6彩色多普勒超声诊断仪的腔内探头（频率5～9 MHz）进行阴道多普勒超声（TV-CDFI）检查，阴道探头涂抹少量耦合剂，置于阴道后穹窿处，测量包括内膜厚度、内膜容积、内膜血流、子宫动脉等。①内膜厚度：取子宫纵切面，测量子宫内膜垂直最大距离（即内膜交界面与垂直于宫腔中线的子宫前、后肌层的最大距离）。②内膜容积：容积角度80°，使用3D及PD功能键，容积取样框取适宜大小，包绕所有子宫内膜，嘱患者保持位置固定，同时保持探头位置固定，启动容积扫查，获得三维能量容积数据，应用VOCAL分析软件，自动计算容积数据。③子宫内膜螺旋动脉血流参数：测定空间最大血流速度的时间平均值（M），舒张末期血流速度（D）和收缩期峰值血流速度（S），计算动脉阻力指数（RI）和搏动指数（PI）。RI=（S-D）/S，PI=（S-D）/M。④子宫动脉血流参数：测量Vmean、Vmax、RI和PI。⑤观察子宫内膜多层率。（2）比较两组治疗前后的内膜分型。子宫内膜分型按照Gonen标准进行划分，分为A、B和C型，多层内膜或三线征为A型，弱三线征为B型，无宫腔中线回升，均质强回声为C型[5]。（3）比较两组治疗前后的Salle评分。在卵泡成熟时，根据Salle评分标准进行超声评分，包括子宫内膜血流（缺失为0分，存在为3分）、子宫内膜厚度（<7 mm为0分，>7 mm为3分）、舒张末期血流量（缺失为0分，存在为4分）、舒张早期切迹（存在为0分，缺失为2分）、子宫动脉PI（>3为0分，≤3为4分）、肌层回声（不均匀为0分，均匀为3分）、子宫内膜分层（无分层为0分，多层为1分），计算Salle评分数值，满分20分[6]。（4）比较两组治疗前后的GLUT4和整合素αvβ3表达。在患者同意且排除妊娠的前提下，采用Medscand Eddorette管吸取部分内膜组织，并用10%甲醛溶液处理（固定、脱水），石蜡包埋切片后，备用。进行免疫组化检测，采用北京航空航天大学病理图像分析系统3.0版进行定量分析，棕黄色或褐色颗粒为阳性反应物，染色明显高于背景。普通光源照明，放大倍数为200倍，对每张玻片均随机在高分辨率图像监视器下选取5个视野，测定光密度值（OD）（每个视野的阳性表达），该片的值为其平均值。检测子宫内膜腺上皮细胞的细胞质和间质细胞的阳性表达情况。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验，不符合正态分布的取10为底对数（ln）转化为正态分布;计数资料以率（%）表示，比较采用χ检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

2.2 两组治疗前后超声相关变量比较 治疗前，两组内膜厚度、内膜容积、内膜螺旋动脉RI、内膜螺旋动脉PI、子宫动脉Vmean、Vmax、子宫动脉PI、子宫动脉RI和子宫内膜多层率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后，两组内膜厚度、内膜容积均高于治疗前，内膜螺旋动脉RI和PI、子宫动脉PI和RI、子宫内膜多层率均低于治疗前，差异均有统计学意义（P<0.05）。治疗后，两组子宫动脉Vmean和Vmax均高于治疗前，且研究组均高于对照组，但差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后，研究组患者内膜厚度、内膜容积均高于对照组，内膜螺旋动脉RI和PI、子宫动脉PI和RI、子宫内膜多层率均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 两组治疗前后内膜分型比较 治疗前，两组内膜分型比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，研究组内膜分型优于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.4 两组治疗前后Salle评分比较 治疗前，两组Salle评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，两组Salle评分均高于治疗前，且研究组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.5 两组治疗前后GLUT4和αvβ3表达比较 治疗前，两组GLUT4和αvβ3表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗后，两组GLUT4和αvβ3均高于治疗前，且研究组均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表5。

3 讨论

PCOS的患病率呈逐年上升的趋势，对妇女的生活质量和身心健康有严重影响。研究显示，PCOS患者糖代谢异常、雄激素水平高、排卵率降低，而胰岛素抵抗是PCOS发生内分泌紊乱及代谢紊乱的主要原因[7]。二甲双胍作为口服降糖药的一种，可以通过多个机制降低血糖，其主要机制为抑制肝糖原的合成、增加胰岛素敏感度和延缓胃肠道对葡萄糖的吸收等，可以下调雄激素水平，有助于排卵，促进卵泡发育，近年来广泛应用于PCOS患者的治疗中[8]。在PCOS患者中，25-羟基维生素D缺乏现象较为普遍，25-羟基维生素D水平大多<20 μg/L。PCOS患者的生育功能下降、高心血管疾病危险、高雄激素表现、胰岛素抵抗等与维生素D缺乏有关[9]。与维生素D相关的PCOS发病机制可能是体内细胞内外钙离子的活动与维生素D有关，钙离子与维持胰岛素敏感关系密切。通过多方临床对比，维生素D水平的最佳评价指标是25-羟基维生素D。25-羟基维生素D可激活胰岛素基因的转录，维生素D的反应原件被人胰岛素基因启动子序列覆盖，胰岛素分泌随着钙离子流向的改变而受到影响。胰岛素抵抗部分效应会被维生素D代谢产物浓度增加而抵消，另外维生素D可增强胰岛素功能，增加葡萄糖转运效率，提高胰岛素受体表达[10]。适当补充维生素D可改善PCOS妇女生殖内分泌状态，减轻PCOS危险因素。

在受孕过程中，子宫内膜容受性是重要的条件之一，特定时间内允许胚胎着床的能力称为子宫内膜容受性，具有明显的时间限制。因此，子宫内膜容受性的改善也可以使受孕率提高。目前尚无确定的评价指标对子宫内膜容受性进行准确评价。子宫内膜容受性的评价手段包括芯片技术、胚胎种植窗期间分子标志物、蛋白、相关基因检测，彩色多普勒超声检查等。经阴道彩色多普勒超声（transvaginal color Doppler flow imaging，TV-CDFI）可定量直观分析血流分布状况，测量子宫及卵巢的血流动力学参数，是生殖医学领域近年来研究的热点。用于评价内膜容受性的超声指标包括内膜下血流情况及子宫动脉血流情况等生理学指标和内膜容积、内膜类型、内膜厚度等解剖学参数。正常情况下，排卵期子宫动脉血流阻力降低，舒张期血流量增多，随着血流灌注的增加，子宫内膜快速增长。以往研究发现，子宫内膜动脉血流参数可评价子宫内膜容受性，反映内膜血流灌注情况和子宫的血流供给[11]。有研究发现，PCOS患者合并高胰岛素血症、肥胖和高雄激素血症等病理指标的患者子宫内膜血流灌注受到黄体期和卵泡期较高的子宫动脉血流阻力的影响[12]。女性妊娠率随着子宫内膜从A型向B、C型转变而逐渐下降。本研究结果显示，治疗前，两组内膜分型比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后，研究组内膜分型优于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。以利于形成较佳的妊娠环境。同时调节子宫动脉血流与内膜血流灌注，降低內膜多层率，利于内膜的增长，提供较好的胚胎着床环境。以往研究对比促排卵周期和自然周期的子宫动脉和内膜动脉各个血流参数发现，发现内膜下血流和内膜血流可较好地反映内膜血流灌注，而子宫动脉参数无法准确判断内膜血供。本研究结果显示，治疗后，两组子宫动脉Vmean和Vmax均高于治疗前，且研究组均高于对照组，但差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后，研究组患者内膜厚度、内膜容积均高于对照组，内膜螺旋动脉RI和PI、子宫动脉PI和RI、子宫内膜多层率均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。这可能与子宫动脉评价意义较低有关。在超声水平上进行子宫内膜容受性评价，Salle评分具有准确率高、易操作、更加简单等特点。Salle评分从子宫内膜形态、内膜厚度、肌层回声、子宫动脉舒张期末血流、舒张期前切迹、子宫动脉PI等方面进行子宫内膜容受性综合评价，较单方面评价更准确。Salle评分最高20分，评分越高妊娠率越高。本研究结果显示，治疗后，两组Salle评分均高于治疗前，且研究组高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。改善子宫内膜容受性。结合血流分析等血流指标是评估子宫内膜容受性的一个新的研究方向。

妊娠生理中，子宫内膜对胚胎的接受能力是胚胎成功植入的关键因素。子宫对胚泡的接受状态的生物活性分子指标之一是整合素。作为一种跨膜糖蛋白受体家族，整合素广泛存在于人体的各种组织细胞，是一种异源二聚体，由α、β两个亚单位共价键的形式结合形成。以往研究发现，子宫内膜的整合素αvβ3与胚胎着床有关[13-14]。子宫内膜容受性缺陷与整合素的表达异常有关。PCOS患者内膜容受性下降，影响怀孕。评价子宫内膜容受性的公认的标志性指标是整合素αvβ3，子宫内膜容受性越好，则αvβ3阳性表达水平越高。子宫内膜内整合素αvβ3的存在意味着对胚胎良好的接受性，临床上监测整合素αvβ3有重要指导意义。作为葡萄糖转运蛋白家族成员之一的GLUT4是一种糖蛋白，其含有509个氨基酸单一多肽链，分子量45～55 ku，与糖代谢关系密切，是唯一一种胰岛素反应性葡萄糖转运蛋白。GLTU4在肌肉和脂肪细胞内转运葡萄糖。足够量的葡萄糖代谢参与了子宫内膜细胞的成熟和分化。子宫内膜腺体组织成熟过程中GLUT4发挥了重要作用。PCOS患者局部子宫内膜正常功能与代谢可能受影响，导致子宫内膜容受性缺陷，妊娠率降低，胚胎着床障碍[15]。GLUT4表达减少降低了对葡萄糖的转运能力，降低了子宫内膜细胞糖代谢水平，细胞对葡萄糖的利用能力下降，最终影响子宫内膜功能，引起胚胎着床失败。作为胰岛素增敏剂，二甲双胍可以纠正PCOS患者代谢异常，改善内膜IR，提高内膜胰岛素敏感性，恢复子宫内膜功能，减少子宫内膜病变，提高妊娠率。

本研究结果显示，治疗前，两组GLUT4和αvβ3表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;治疗后，两组GLUT4和αvβ3均高于治疗前，且研究组均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。这说明，在超声水平和分子水平均可证实，二甲双胍可改善子宫内膜容受性。研究组患者加用维生素D治疗后，GLUT4表达升高，这说明维生素D联合二甲双胍可增强子宫内膜代谢水平，增加子宫内膜对葡萄糖的利用，有利于子宫内膜容受性的增加，有利于胚胎着床。超声以其可重复性、直观、无创及方便的优点得到广泛应用，各种生物活性分子表现了较为显著的时空表达特征，进一步研究从基因水平上的基因标志物进一步阐明子宫内膜容受性机制，为以后临床工作提供应用方案，为PCOS患者自然流产及不孕治疗提供新方案。

综上所述，对胰岛素抵抗的多囊卵巢综合征患者采用维生素D联合二甲双胍治疗，可改善子宫内膜容受性超声指标，增加子宫动脉血流，从生物活性分子水平上改善内膜容受性。

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（收稿日期：2020-09-29） （本文编辑：张明澜）