半夏泻心汤对2型糖尿病模型大鼠肝细胞线粒体未折叠蛋白反应的影响

马丽娜 马丹 许欣竹 王艺璇 刘文俊 段志园 单德红

【摘要】 目的：圍绕肝细胞线粒体的形态、产能和线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt），研究半夏泻心汤治疗2型糖尿病的可能机制。方法：选取若干只SPF级雄性SD大鼠，适应性喂养1周后，随机选取8只为正常组给予普通饲料喂养，其余给予高脂高糖饲料喂养4周后，腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导T2DM模型;将造模成功的大鼠24只，随机分为模型组、半夏泻心汤组（中药组）、二甲双胍（MET）组，每组8只。采用血糖仪检测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）;比色法和分光光度计法测定肝组织ATP和反应性氧簇（reactive oxygen spieces，ROS）含量;透射电镜观察肝细胞线粒体超微结构;Western blot法检测UPRmt相关蛋白表达。结果：模型组、MET组和中药组的体质量均低于正常组，FPG均高于正常组，差异均有统计学意义（P<0.05）。MET组和中药组的FPG均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组和MET组的ATP均低于正常组，且中药组高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组和中药组的ROS均高于正常组，但MET组和中药组均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组线粒体肿胀，电子密度下降;MET组和中药组线粒体形态基本正常，但也有电子密度下降情况。中药组LonP表达高于正常组、模型组和MET组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组ClpX表达低于正常组，MET组、中药组均高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组ClpP表达低于正常组，MET组、中药组均高于模型组，且中药组高于MET组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：T2DM发生时肝细胞UPRmt损伤，而半夏泻心汤可能通过提升UPRmt而保护肝细胞线粒体，从而有效干预2型糖尿病。

【关键词】 2型糖尿病 肝细胞 线粒体未折叠蛋白反应 半夏泻心汤 二甲双胍

Effects of Banxia Xiexin Decoction on Mitochondrial Unfolded Protein Response of Liver Cells in Type 2 Diabetes Mellitus Mode Rats/MA Li’na， MA Dan， XU Xinzhu， WANG Yixuan， LIU Wenjun， DUAN Zhiyuan， SHAN Dehong. //Medical Innovation of China， 2021， 18（32）： 00-006

[Abstract] Objective： To study the possible mechanim of Banxia Xiexin Decoction treating type 2 diabetes mellitus （T2DM） based on mitochondrial morphology， generating energy and mitochondrial unfolded protein response （UPRmt） in liver cells. Method： A number of SPF male SD rats were selected， after 1 week of adaptive feeding， 8 rats were randomly selected to be fed with normal diet， and the rest were fed with high fat and high sugar diet for 4 weeks， then Streptozotocin （STZ） was intraperitoneally injected to induce T2DM model. 24 rats were randomly divided into model group， Banxia Xiexin Decoction group （Chinese medicine group） and Metformin （MET） group， with 8 rats in each group. Glucomere was used to detect rat fasting plasma glucose （FPG）; colorimetry and photometer were employed to measure ATP and reactive oxygen spieces （ROS） levels respectively; transmission electron microscopy was applied to observe mitochondrial ultrastructures in liver cells; Western blot was chosen to detect expressions of proteins related UPRmt. Result： Body mass of the model group， MET group and Chinese medicine group were lower than that of the normal group; FPG of the model group， MET group and Chinese medicine group were higher than that of the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The FPG of the MET group and Chinese medicine group were lower than that of the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. ATP of the model group and MET group were lower than that of the normal group， but that of the Chinese medicine group was higher than that of the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. ROS of the model group and Chinese medicine group were higher than that of the normal group， but MET of the model group and Chinese medicine group were lower than that of the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Mitochondrial swelling and electron density decreased in model group. The morphology of mitochondria in the MET group and Chinese medicine group were basically normal， but electron density also decreased. LonP expression of the Chinese medicine group was higher than those of the normal group， the model group and the MET group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression of ClpX of the model group was lower than that of the normal group， while those of the MET group and the Chinese medicine group were higher than that of the model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression of ClpP of the model group was lower than that of the normal group， but those of the MET group and Chinese medicine group were higher than that of the model group， and Chinese medicine group was higher than that of the MET group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： UPRmt is damaged in T2DM liver cells， and Banxia Xiexin decoction might protect liver cell mitochondria via enhancing UPRmt to treat T2DM effectively.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus Liver cell Mitochondrial unfolded protein response Banxia Xiexin Decoction Metformin

First-author’s address： Integrated Chinese and Western Medicine College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.32.001

近年来，关于半夏泻心汤治疗2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的报道较多，但相关作用机制尚不清楚[1-4]。T2DM以胰岛素不足和/或胰岛素抵抗为特征，肝细胞是胰岛素的靶细胞之一。肝细胞影响血糖的途径主要是糖原的合成与分解、糖异生和糖脂转化等，而这些活动均为能量依赖式，因此肝细胞线粒体健康对于血糖稳态极为重要。实际上，肝细胞线粒体损伤广泛参与了T2DM的发生发展[5-6]。

线粒体基质蛋白众多，主要由核基因编码，但部分呼吸链复合体由线粒体基因参与编码。细胞内存在多种线粒体质量控制机制，其中线粒体内的主要是线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt），即错误折叠或损伤的蛋白可由热休克蛋白（hot shock protein， HSP）重新折叠修复，而难以修复的则由Lon蛋白酶（Lon protease， LonP）和ClpXP等分解清除[7-8]。关于肝细胞UPRmt在T2DM中变化目前还没有报道。本研究主要采用透射电镜和分生等技术，观察半夏泻心汤对T2DM大鼠肝细胞线粒体超微结构和产能等影响，进而从UPRmt方面探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，平均体质量（200±10）g，购于辽宁省本溪市实验动物中心，许可证号：SCXK（辽）-2010-0001，于本校实验动物中心[许可证号：SYXK（辽）-2013-000-9]适应性饲养1周后开始实验。饲养条件：（24±2）℃;光照周期12 h/12 h;相对湿度45%～55%;自由进食水。

1.2 主要药物、试剂、抗体及仪器 （1）主要药物。半夏泻心汤（法半夏12 g、黄芩9 g、干姜9 g、人参9 g、酒黄连3 g、大枣4枚、炙甘草9 g）购自本校第一附院药房，常规水煎煮、过滤、浓缩（生药1 g/mL）和冷藏;链脲佐菌素[Streptozocin（STZ），购自Gentihold，批号：S0130];盐酸二甲双胍（Metformin，MET）片（生产厂家：中美上海施贵宝制药有限公司，批准文号：国药准字H20023370，规格：0.5 g/片）。（2）主要试剂。总蛋白提取试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司（批号：K21128）;BCA法蛋白含量测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司（批号：PC0020）;ATP含量测定试剂盒和EasySee Western Blot发光液均购于北京全式金生物技术有限公司（批号：K20103、10419）;过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒购自索莱宝生化试剂盒事业部（批号：BC3595）;蛋白Marker来自上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0079）。（3）主要抗体。HSP70抗体、LonP和ClpP多克隆抗体、actin、山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均购于Proteintech（批号：00055287、00022581、00023008、10004156、20000174、20000002）;ClpX多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司（批号：0001812Day77812）。（4）主要仪器。透射电镜，日本电子（型号：JEM-1011）;高速冷冻离心机，美国ThermoSientific（型号：ST-16R）;电泳仪和转膜仪，均购自美国Bio-Rad公司（型号：042BR14173;690BR024666）;显影仪，上海天能科技有限公司（型号：Tanon5200）;血糖仪，中国鱼跃公司（YUWELL）。

1.3 大鼠T2DM模型复制和分组 所有大鼠适应性喂养1周后，随机选取8只为正常组给予普通饲料喂养，其余给予4周高脂高糖大鼠饲料（生产厂家：沈阳茂华生物技术有限公司：20%果糖、12%猪油、5%脱脂奶粉、2%鸡蛋黄和61%普通饲料），禁食水12 h后腹腔内注射STZ溶液，45 mg/kg;STZ溶于pH值4.4的0.1 M枸橼酸缓冲盐溶液，10 min内注射完成，之后继续喂饲高脂高糖饲料，72 h后测定空腹尾静脉血糖（fasting plasma glucose，FPG），当其≥16.7 mmol/L或连续3 d≥11.1 mmol/L为造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、MET组（MET组）和半夏泻心汤组（中药组），每组8只。

1.4 治疗方法 正常组施加灌胃动作，模型组灌服2 mL盐水，MET组灌服盐酸二甲双胍（溶于蒸馏水中，现用现配）0.3 g/kg，中药组灌胃半夏泻心汤（用前恢复到室温，按成人用药量折算为大鼠用量）0.85 g/kg，1次/d。治疗连续8周，其中每日8时各组大鼠称重后更新给药量，同时密切观察大鼠的精神状态、毛色、饮食和二便等变化。

1.5 肝细胞线粒体超微结构观察 按文献[9-10]方法，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/

100 g）麻醉，开腹取肝组织，4 ℃下切成约1 mm3小块，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗，1%锇酸固定，乙醇、丙酮梯度脫水，环氧树脂包埋聚合，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染，镜下选择线粒体丰富处观察并拍片。

1.6 肝组织ATP和H2O2水平检测 分别采用比色法和分光光度计法检测。按上法取肝组织，制备组织匀浆，分别检测各组ATP和H2O2（代表反应性氧簇，reactive oxygen spieces，ROS）水平，严格按照说明书操作。

1.7 蛋白表达 采用Western blot（WB）法。按文献[11-13]所载方法，取50 mg肝组织，盐水洗净后置于无菌EP管内，每管加入300 μL裂解液，静置30 min，冰上充分研磨，吸取溶液后4 ℃下

14 000×g离心10 min，取上清液;BCA法测定蛋白浓度;每管加入2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100 ℃变性;各组取相同质量总蛋白上样量50 μg计算上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转移至PVDF膜（25 V，1.0 A，30 min）;根据Marker提示分子量切膜，以5%脱脂奶粉封闭后，加入HSP70、LonP、ClpX、ClpP与actin各5 mL，4 ℃搖床过夜;TBST洗膜，前4个加入5 mL HRP标记山羊抗兔二抗，后者5 mL HRP记山羊抗鼠二抗，室温孵育2 h;TBST洗膜;滴加ECL发光液，曝光显影后，应用AlphaView SA软件分析蛋白的相对表达量。

1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模成功情况 正常组大鼠毛色润泽，反应灵敏，无死亡和脱失。造模过程中，模型组大鼠的毛色逐渐晦暗无光泽，反应迟钝，出现多饮、多食和二便增加等，且垫料潮湿，味道加重。

2.2 四组治疗后体质量、FPG、肝组织ATP和ROS水平变化 模型组、MET组和中药组的体质量均低于正常组，FPG均高于正常组，差异均有统计学意义（P<0.05）。MET组和中药组的FPG均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组和MET组的ATP均低于正常组，且中药组高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组和中药组的ROS均高于正常组，但MET组和中药组均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 四组肝细胞线粒体超微结构变化 细胞核附近可见多个线粒体，正常组线粒体为圆形，边缘清楚，内部致密，可见片状嵴;模型组线粒体大小不一，存在肿胀和内部电子密度下降现象，嵴不清楚;MET组和中药组变化相似，线粒体为圆形和杆状，外膜清楚，嵴为片状，但也有电子密度下降情况。见图1。

2.4 肝细胞UPRmt相关蛋白表达 每组选取4只小鼠进行测定。正常组、模型组、MET组、中药组HSP70表达分别为（0.864±0.042）、（0.698±0.065）、（0.815±0.098）和（0.772±0.087）。正常组、模型组、MET组、中药组LonP表达分别为（0.478±0.071）、（0.523±0.034）、（0.461±0.173）和（0.752±0.050）。正常组、模型组、MET组、中药组ClpX表达分别为（0.573±0.061）、（0.318±0.069）、（0.731±0.127）和（0.690±0.109）。正常组、模型组、MET组、中药组ClpP表达分别为（0.496±0.040）、（0.312±0.096）、（0.544±0.118）和（0.763±0.052）。四组HSP70表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。中药组LonP表达高于正常组、模型组和MET组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组ClpX表达低于正常组，MET组、中药组均高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组ClpP表达低于正常组，MET组、中药组均高于模型组，且中药组高于MET组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2。

3 讨论

T2DM发生时肝细胞线粒体结构与功能损伤多有报道[14-15]。本研究也观察到类似现象，如模型组线粒体出现肿胀、峭减少、ATP合成减少和ROS增加等。因为线粒体产能主要源于附着于内膜嵴上呼吸链的氧化磷酸化反应，所以上述变化提示呼吸链出现损伤。实际上，在T2DM发生时，肝细胞线粒体蛋白损伤较为广泛，进而干扰了β-氧化、三羧酸循环、氧化磷酸化、抗细胞凋亡和抗氧化应激等众多反应，因此肝细胞线粒体是T2DM治疗的重要靶点[16]。

MET是常用降糖药。体外实验发现，MET在肝细胞线粒体内的浓度高于胞外约100倍，10～100倍治疗剂量的MET能够抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性，从而干扰糖异生，减少肝糖输出[17-18]。体内研究报道，治疗剂量的MET虽然抑制糖异生，却未影响呼吸链复合体Ⅰ[19]。因此，MET对肝细胞线粒体的作用还需探讨[20]。本研究观察到，MET能够降低FPG，在一定程度上恢复肝细胞线粒体形态，虽未提升ATP水平，但降低了ROS含量，表明MET能够减轻肝细胞线粒体损伤。在此基础上，本研究围绕UPRmt探讨MET的可能作用机制。

HSP为分子伴侣，其在线粒体内的作用主要是蛋白组装，并赋予其相应功能，也可以对错误折叠或损伤的蛋白进行再折叠。LonP和ClpXP属于AAA+超家族，前者能够识别并降解异常蛋白;后者由ClpX和ClpP组成，其中ClpX可以展开异常蛋白，ClpP负责分解[21-22]。本研究结果显示，相对于正常组，模型组的HSP70和LonP表达没有变化，但ClpXP表达下降，提示T2DM发生后，肝细胞UPRmt下降;与模型组比较，MET组的HSP70和LonP表达没有改变，但ClpXP表达增加，表明MET能够在一定程度上提升UPRmt，从而维持线粒体蛋白稳态。

与西医认识不同，中医认为糖尿病为虚实夹杂，治疗当随证施为，而调畅中焦气机和温脾清胃是一条重要思路[23-24]。半夏泻心汤能够辛开苦降，宣通三焦气机，温而不耗胃阴，寒而不伤脾阳，对T2DM具有较好疗效[1-4]。本研究结果显示，半夏泻心汤能够降低血糖，改善肝细胞形态，提高ATP水平，减少ROS产生，提示该方能够较好地改善T2DM大鼠肝细胞线粒体形态和产能。而在UPRmt方面，中药组的HSP70表达虽与其他三组没有明显变化，但LonP和ClpXP等表达均高于模型组，且LonP和ClpP表达均高于MET组，提示半夏泻心汤能更好地启动UPRmt，增强线粒体蛋白质控水平，从而维持肝细胞线粒体蛋白稳态。

综上所述，本研究认为T2DM发生时肝细胞UPRmt损伤，而半夏泻心汤可能通过提升UPRmt而保护肝细胞线粒体，从而有效干预2型糖尿病。

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（收稿日期：2021-09-13） （本文编辑：张明澜）