特征图谱结合模式识别方法在半边莲质量控制中的应用

曾慧芬，贾 磊，麦 曦，李 娜，陈 葶，李 健

(南昌大学药学院，南昌 330006)

中药化学成分复杂，多成分、多靶点的作用特性使其同时具有多种药用价值，仅从单一成分入手难以表征其质量特性。中药指纹图谱作为一种综合的、整体的中药质量控制技术，已得到广泛应用，该技术能综合反映中药质量，具有分析快速、分离效能高、应用设备普遍等优点[1]。中药特征图谱是在指纹图谱基础上提取出典型的共有特征峰进行中药质量控制的技术，该技术既有指纹图谱综合评价的优点又兼顾了中药来源的多变性和复杂性，强调的是中药的典型特征成分，而非全部成分，较指纹图谱更加符合中药的具体实际情况[2-3]。模式识别能根据大批样品的分析数据进行分类研究，常用的方法有主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLSDA)及正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等。将模式识别方法与中药特征图谱结合，能快速而有效地处理数据并挖掘出有价值的信息，从而能更好地控制中药质量[4-6]。

半边莲为桔梗科植物半边莲的干燥全草，始见于《滇南本草》，后在李时珍所著的《本草纲目》中也有详细记载，性辛、平，归心、肺、小肠经，为清热解毒、利尿消肿之良品[7-8]。半边莲在我国分布广泛，属于临床常用中药材，其质量标准现收载于2015年版《中国药典》[9]，但其仅对半边莲的性状、水分和浸出物等进行质量控制，很难保证该药材的质量。文献[10]对产自安徽、江苏、浙江、湖北及广西的10批半边莲建立了指纹图谱，采用中药指纹图谱相似度软件进行相似度的评价，发现即使是产地相同的半边莲药材相似度也存在较大差异。因此，有必要更广泛地收集全国各产地的半边莲药材进行深入研究，以完善其质量控制方法。本工作收集了全国各产地的半边莲药材和半边莲饮片(共48批)，建立特征图谱，并进行了特征峰的归属和鉴定，还采用模式识别方法对48批样品的特征图谱进行数据拟合分析，建立了有效判别模型，能对半边莲药材和半边莲饮片进行分类，并确定出半边莲中的香叶木苷和蒙花苷对半边莲药材和半边莲饮片的分类贡献较大，从而对这2个组分建立了测定方法，为半边莲的质量控制提供了方法基础和依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AD 型二元泵高效液相色谱仪，配DGU-20A3型真空在线脱气机、SIL-20A 型自动进样器、SPD-20A 型二极管阵列检测器；KQ-250B型超声波清洗器。

香叶木苷和蒙花苷混合标准溶液:含8.000 mg·L－1香叶木苷和4.000 mg·L－1蒙花苷，称取适量的香叶木苷和蒙花苷，用适量二甲基亚砜(DMSO)溶解并用甲醇稀释而成。

香叶木苷对照品的纯度不小于98%；蒙花苷对照品的纯度不小于96.6%；甲醇为色谱纯；试验用水为纯净水。

1.2 色谱条件

Inertsil-ODS 3-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，柱温25 ℃；进样量10μL；流量1.0 mL·min－1；检测波长360 nm。流动相:A 为甲醇，B 为水。梯度洗脱程序:0～8 min 时，A 由40%升至45%；8～15 min 时，A 由45%升至60%；15～22 min时，A 由60%升至65%；22～30 min时，A由65%升至70%；30～40 min 时，A 由70%升至75%；40～45 min时，A 由75%降至40%。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

24批半边莲药材(S1～S24)产自湖南、福建、江西、安徽、四川、贵州、江苏、浙江、广东、广西、湖北等11个产地；24批半边莲饮片(Y1～Y24)由江西、贵州、河北、浙江、河南、安徽、广西、四川、海南等地的18个饮片生产企业生产。

将半边莲药材或半边莲饮片研磨后过0.25 mm(4号)筛，称取半边莲粉末样品约1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%(体积分数，下同)甲醇溶液25 mL，密塞，称定质量，超声提取(功率250 W，频率40 k Hz)30 min，冷却至室温。再次称定质量，用70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液按色谱条件进行测定。

1.3.2 数据处理

将48批半边莲样品在波长360 nm 处测得的色谱数据导出，采用Excel软件进行峰对齐处理，将数据导入SIMCA-P 13.0软件，采用自动标度化程序进行预处理后用于模式识别。首先采用PLS-DA程序进行数据分析，然后采用OPLS-DA 程序使数据(峰强度)和响应变量(预测分类)的协方差最大化。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

试验考察了甲醇-0.2%(体积分数)磷酸溶液体系、乙腈-水体系和甲醇-水体系作为流动相时梯度洗脱的效果。结果表明:采用甲醇-水体系进行梯度洗脱时，色谱峰分离度较好，响应值较高，基线平稳。试验选择流动相为甲醇-水体系。

试验通过二极管阵列检测器在190～400 nm进行全波长扫描，考察了检测波长依次为249，254，308，360 nm 时的色谱峰形态。结果表明:检测波长为360 nm 时，色谱峰形态较好且基线平稳，主要色谱峰分离度好，干扰峰较少。试验选择检测波长为360 nm。

2.2 提取方法的选择

试验考察了减压浓缩、加热回流以及不同溶剂超声等提取方法对半边莲特征峰出峰情况的影响。结果表明:提取方法为减压浓缩及加热回流时，样品中各目标成分响应值相差较大，色谱峰多而杂，分离度不好；样品采用70%甲醇溶液超声提取30 min后，获得的色谱峰数量和强度适宜，且分离度较好。试验选用70%甲醇溶液超声提取样品30 min。

2.3 特征峰和参照物峰的指认

分别取不同产地的半边莲药材和半边莲饮片共37批，按试验方法进行分析，得到其特征图谱，发现半边莲有5个共有特征峰。

半边莲对照品的特征图谱见图1。

将半边莲对照品的特征图谱数据与多个香叶木苷对照品、蒙花苷对照品等的图谱数据进行比较，确定1号峰和3号峰分别为香叶木苷和蒙花苷，其中蒙花苷峰保留时间适中，与邻近峰的分离度良好，可将其作为参照物峰。计算各特征峰与参照物峰的相对保留时间作为特征参数。

2.4 样品特征图谱测定及模式识别分析

按试验方法测定48 批样品(S1～S24，Y1～Y24)的特征图谱，将特征图谱数据导入SIMCA-P 13.0软件，启动PLS-DA 程序，拟合提取得到4 个主成分，能说明85.3%的X变量和88.7%的Y变量的变化，拥有49.8%的预测能力，模型的预测能力不好。在软件中继续启动OPLS-DA 程序，拟合提取得到4 个主成分，能说明85.3%的X变量和88.7%的Y变量的变化，拥有75.9%的预测能力，表明建模成功，可用于半边莲特征图谱的模式识别。

OPLS-DA 程序拟合分析的得分散点图见图2。

图2 OPLS-DA 程序拟合分析的得分散点图Fig.2 Score scatter plot of fitting analysis by OPLS-DA program

由图2可知:除S7和Y17外，46个批次的半边莲样品的数据点均落在95%的置信区间内；饮片组中Y1较接近药材组，其他药材和饮片各自聚集，且明显区分开，说明半边莲药材和半边莲饮片的特征图谱存在一定差异。

S7和Y17为在95%置信区间外的异常值，提示二者的特征图谱存在不同之处。将Y1、S7 和Y17进行标记后，提取三者的图谱与正常组分S1进行比较，样品(S1、Y1、S7和Y17)的特征图谱见图3。

图3 样品(S1、Y1、S7和Y17)的特征图谱Fig.3 Characteristic chromatograms of the samples(S1，Y1，S7 and Y17)

由图3可知:S7的特征峰5的响应值较大，Y17的特征峰4的响应值较大，异于其他批次样品从而造成差异。

饮片Y1介于药材组和饮片组之间，或许兼具药材组和饮片组的共性。从得分散点图的距离及特征图谱的比较来看，Y1靠近S1，S1的半边莲药材产于湖南攸县，Y1 的半边莲饮片的产地为湖南怀化，Y1与S1相近的原因或许与这两批半边莲的产地相近从而成分相近有关。

筛选变量重要性值大于1的成分，5个特征峰的变量重要性值依次如下:香叶木苷为3.14，蒙花苷为1.98，峰2为1.89，峰4为0.41，峰5为0.16。香叶木苷和蒙花苷这两个组分对半边莲药材和半边莲饮片的分类贡献较大，提示应对这两个已知组分建立质量控制方法，需建立香叶木苷和蒙花苷含量的测定方法。

2.5 标准曲线和检出限

按色谱条件对含0.399 7，1.998，7.993，11.99，19.98，39.97 mg·L－1香叶木苷和0.185 5，0.927 6，3.711，5.566，9.277，18.55 mg·L－1蒙花苷的混合标准溶液系列进行测定，以香叶木苷和蒙花苷的质量为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

香叶木苷和蒙花苷的线性范围、线性回归方程和相关系数见表1。

根据3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)，结果见表1。

表1 线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限Tab.1 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.6 精密度和回收试验

按色谱条件对香叶木苷和蒙花苷混合标准溶液连续进样6次，测定香叶木苷和蒙花苷峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果分别为0.47%，1.4%，仪器精密度良好。

按试验方法对同一批次半边莲粉末样品进行分析，平行测定6次，并进行加标回收试验，计算回收率和测定值的RSD，结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 稳定性试验

按色谱条件将香叶木苷和蒙花苷混合标准溶液分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定。结果表明:香叶木苷、蒙花苷峰面积的RSD 分别为1.2%，1.8%。这表明香叶木苷和蒙花苷混合标准溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 样品分析

按试验方法对半边莲药材样品和半边莲饮片样品进行分析，结果见表3。

表3 样品分析结果Tab.3 Analytical results of the samples

表3 (续)

由表3可知:半边莲药材中香叶木苷的质量分数为0.225 8～0.381 6 mg·g－1，平均值为0.322 1 mg·g－1，蒙花苷的质量分数为0.036 15～0.308 6 mg·g－1，平均值为0.077 96 mg·g－1；半边莲饮片中香叶木苷的质量分数为0.218 6～0.369 9 mg·g－1，平均值为0.291 9 mg·g－1，蒙花苷的质量分数为0.031 01～0.137 5 mg·g－1，平均值为0.059 26 mg·g－1。半边莲药材中香叶木苷和蒙花苷的含量均高于半边莲饮片中香叶木苷和蒙花苷的含量，或许这是造成半边莲药材和半边莲饮片分类差异的原因之一。虽然S7和Y17为模式识别分析中的异常值，但两者的香叶木苷和蒙花苷含量无异常之处，可见这两批样品与其他样品的差异不是由香叶木苷和蒙花苷的含量差异造成的，而主要是由特征峰4和特征峰5的较大差异造成的。

本工作采用高效液相色谱法建立了半边莲的特征图谱，其具有5个典型特征峰，其中的1 号峰和3号峰分别为香叶木苷和蒙花苷。通过模式识别方法对48批半边莲样品建立OPLS-DA 模型，该模型能够成功区分半边莲药材和半边莲饮片，并发现其中的差异样品，通过对差异样品进行标记和提取相关图谱进行比较，揭示了产生差异的原因。筛选变量重要性值大于1的成分，香叶木苷和蒙花苷对半边莲药材和半边莲饮片的分类贡献较大，因此建立了香叶木苷和蒙花苷的含量测定方法，全面测定48批半边莲样品中香叶木苷和蒙花苷的含量。半边莲饮片中香叶木苷和蒙花苷的含量均低于半边莲药材中香叶木苷和蒙花苷的含量，这或许是造成半边莲药材和半边莲饮片分类差异的原因之一。本方法为半边莲的鉴定及质量评价提供了科学依据，对半边莲质量标准的提高有积极意义。