血清微小RNA-33、微小RNA-122水平与冠心病病人Gensini积分的相关性分析
2021-03-24郭伟崇,马金霞,姚方方
冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）是一种常见心血管疾病，好发于中老年人群，随着现代生活方式的改变，该病发病率呈逐年上升趋势，已成为人类致死率最高的疾病之一。微小RNA（microRNA，miRNA）是非编码内源性小分子RNA，长度约为22～25个核苷酸，参与诸多肿瘤疾病的发生发展及细胞增殖凋亡等生物进程。据报道，miRNAs表达水平变化与心血管疾病的发生发展密切相关。近期研究发现，miRNA不仅仅是一种生物标志物，还可能是引起冠心病的又一危险分子。Gensini积分是目前公认的可全面反映冠心病血管病变严重程度的量化指标。目前，国内外关于miR-33、miR-122水平与冠心病病人Gensini积分的相关性分析研究较少。本研究通过观察冠心病病人血清miR-33、miR-122水平及Gensini积分，并分析其相关性。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
随机抽签法选取2014年1月至2015年12月在南阳市第一人民医院做冠脉造影术的冠心病病人200例为冠心病组，男性96例，女性104例，年龄45～75岁，平均年龄（54.69±7.61）岁；对照组120例，男性63例，女性57例，年龄46～77岁，平均年龄（54.32±7.85）岁。本研究中样品的采集获得病人、近亲属的知情同意，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。1.2 选取标准
纳入标准：①冠脉造影术显示至少一支冠脉血管狭窄≥50%者；②所有调查研究均自愿且经病人及其近亲属同意，并签字确认；③年龄均≥40岁。排除标准：①患有恶性肿瘤、严重肝脏、肾脏等脏器功能不全、自身免疫性疾病者；②精神状态异常、生活不能自理者；③伴有心肌梗死、心脏瓣膜病、慢性心肌炎、急性心肌炎、心包炎、先天性心脏病等病人；④患有肺动脉栓塞、结缔组织病者。1.3 方法
1.3.1
主要试剂及仪器 Trizol试剂（DP424）购于天根生化科技有限公司；AceQ qPCR SYBR® Green Mix（货号Q111-02）购于南京vazyme公司；miR-33、miR-122及内参U6引物由上海生工生物公司合成。紫外分光光度计（型号ND-2000C）购于美国Thermo公司、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）仪（型号T100）购于美国Bio-Rad公司。1.3.2
qRT-PCR检测血清miR-33、miR-122水平采集受试者晨起空腹静脉血约5 mL，常温离心10 min（3 500 r/min），收集血清-80℃超低温冰箱中保存备用。采用Trizol试剂提取受试者血清中的总RNA并通过紫外分光光度计测定其中RNA的浓度和纯度。经过反转录得到互补DNA（cDNA），采用qRT-PCR检测受试者血清中miR-33、miR-122的相对表达量。反应体系：10µL miScript SYBR®Green Mix，1µL cDNA（50 mg/L），0.5µL正向、反向引物（10µM），8.0µL双蒸水（ddH2O）。反应条件（40个循环）：95℃（90 s）；95℃（30 s）；63℃（30 s）；72℃（15 s）。miR-33、miR-122、内参U6的引物序列见表1。采用2法分析受试者血清中miR-33、miR-122的相对表达水平。1.3.3
Gensini积分计算标准 冠脉造影检查及Gensini积分由该院资深心内科医师完成，Gensini积分标准参考美国心脏协会规定的冠脉血管图像分段评价标准Gensini积分系统：根据冠状动脉狭窄程度进行评分：正常，0分；≤25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，4分；76%～90%，8分；91%～99%，16分；100%，32分。系数根据不同狭窄部位确定：左主干，系数为5；左前降支近段，系数为2.5，中段，系数为1.5，远段，系数为1.0；第一对角支，系数为1.0，第二对角支，系数为0.5；回旋支近段，系数为2.5，中段，系数为1.5，远段，系数为1.0；后降支，系数为1.0；后侧支，系数为0.5；右冠近、中、远后降支，系数为1.0。根据冠心病的病变支数分组：单支组（回旋支、前降支、右冠任1支发生病变，血管狭窄≥50%）；2支组（回旋支、前降支、右冠任2支有病变，左主干病变属2支组，至少1支血管狭窄≥70%）；3支组（回旋支、前降支、右冠均发生病变，至少1支血管狭窄≥90%）。按照公式计算Gensini积分=（单处病变狭窄程度积分×相应系数）×总支数。
表1 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）引物序列
2 结果
2.1 对照组、冠心病组病人一般资料比较
与对照组相比，冠心病组病人年龄、性别、腰臀比、血清肌酐异常比例和冠心病家族史比例均差异无统计学意义（P
＞0.05），吸烟比例、高血压病史比例、糖尿病病史比例、三酰甘油及低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平显著较高（P
＜0.05）。见表2。
表2 冠心病组和对照组病人一般临床资料比较
2.2 对照组、冠心病组病人血清中miR
-33、miR
-122水平比较
与对照组相比，冠心病组病人血清中miR-33、miR-122水平显著升高（P
＜0.05）。见表3。
表3 冠心病组和对照组血清miR-33、miR-122水平比较/±s
2.3 冠心病组各亚组血清中miR
-33、miR
-122水平及Gensini积分比较
2支组、3支组miR-33、miR-122水平及Gensini积分均较单支组显著升高（P
＜0.001）；与2支组相比，3支组miR-33、miR-122水平及Gensini积分显著升高（P
＜0.001）。详见表4。
表4 冠心病组中各亚组血清中miR-33、miR-122水平及Gensini积分比较/±s
2.4 冠心病各亚组病人血清中miR
-33、miR
-122水平与Gensini积分的相关性分析
Pearson分析结果显示，miR-33水平和Gensini积分呈正相关（r
=0.706，P
＜0.001）；miR-122水平和Gensini积分呈正相关（r
=0.458，P
＜0.001）。2.5 logistic回归分析冠心病的危险因素
为了确定冠心病的危险因素，以冠心病年龄、性别、腰臀比、血清肌酐异常和冠心病家族史、吸烟、高血压病史、糖尿病病史、三酰甘油、LDL含量、血清miR-33、miR-122水平为自变量进行多因素logistic回归分析，结果显示LDL含量、miR-33、miR-122水平及年龄是冠心病的独立危险因素（OR
=1.862，95%CI
：1.359～2.57；OR
=4.157，95%CI
：2.597～6.654；OR
=4.196，95%CI
：2.362～7.453，OR
=1.824，95%CI
：1.213～2.454）。详见图1。
图1 影响冠心病发生的危险因素分析森林图
3 讨论
冠心病是一种常见的心血管疾病，是以动脉粥样硬化为病理基础导致冠状动脉狭窄的一种疾病，该病涉及血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖迁移及炎性介质释放等慢性病变过程。据不完全统计，我国每年因疾病死亡病人中冠心病病人约占50%，且发病率呈逐年上升趋势，目前已经成为危害我国居民健康的第2杀手。因此，加强冠心病预防、丰富早期诊断方法、提高治疗成功率为现阶段研究热点。miRNA是一种内源性小RNA，在进化过程中高度保守，且可稳定存在于血清或血浆等多种液体中，主要通过转录后调控基因表达参与机体的各种生理、病理过程，并与冠心病的发生、发展过程密切相关。因此本实验拟探究miR-33、miR-122水平与冠心病Gensini积分的相关性，以期为冠心病的早期诊断提供一定有价值的理论参考。
本研究发现，冠心病组病人在吸烟比例、高血压病史比例、糖尿病病史比例、三酰甘油及LDL水平显著高于对照组，提示冠心病的发生可能与生活习惯有关，不良生活习惯可能增加冠心病发生风险。进一步研究结果显示，冠心病组病人血清中miR-33、miR-122水平均显著高于对照组，且随着冠心病血管病变支数增多，miR-33、miR-122水平依次升高。miR-33存在于大多数组织中，其基因序列和位置均高度保守，主要包含两个亚型，miR-33a和miR-33b。研究表明，miR-33可以影响固醇合成和脂肪β氧化以及脂质代谢过程，上调miR-33a表达，血浆胆固醇含量会增加，抑制miR-33表达，血浆中胆固醇含量降低，HDL含量显著增加，动脉粥样硬化程度会减弱。有研究发现，过表达miR-33可促进冠心病的发生发展，miR-33可能成为冠心病发生发展的一个生物标志物。miR-122是一种在成年人肝脏细胞中高度表达的miRNA，研究表明，腺病毒高表达miR-122会增加肝脏中合成胆固醇基因如Mmgrcs1、Dhcr7等表达，抑制miR-122表达后，会影响肝脏功能，使胆固醇合成效率降低。胆固醇的合成代谢与冠心病以及其他心血管疾病密切相关。综合以上研究及本研究结果，提示冠心病病人血清miR-33、miR-122高表达与病人病情发展有关。
研究发现，miR-181b在冠心病病人血浆中低表达，与Gensini积分呈负相关，具有抗动脉粥样硬化作用；miR-130a在冠心病病人血浆中高表达，与Gensini积分呈正相关关系，发挥促动脉粥样硬化作用。miR-21可通过抵抗缺血引起的心肌死亡发挥心肌保护作用，在冠心病的发生发展过程中发挥重要作用。以上研究提示，多种miRNA表达可能参与冠心病发生发展。研究显示，miR-33与Gensini积分呈正相关关系，可促进冠心病的发生发展进程。本研究结果显示，miR-33、miR-122在冠心病病人血清中均高表达，且与病人Gensini积分呈正相关，提示血清miR-33、miR-122水平可能与冠心病病人严重程度有关。logistic回归分析结果显示，miR-33、miR-122水平升高、LDL含量增多以及年龄均为冠心病发生的独立危险因素，提示miR-33、miR-122高表达与冠心病发生有关。
综上所述，冠心病病人血清中miR-33、miR-122表达水平均显著上调，且与Gensini积分正相关，是影响冠心病发生的危险因素，推测检测血清miR-33、miR-122水平可能作为评估冠心病病人病情的指标，其具体机制有待进一步研究。
