钙激活的氯离子通道A4通过抑制JAK激酶2/信号转导及转录激活蛋白3信号通路对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

食管癌是临床常见恶性肿瘤之一，其主要病理类型为食管鳞癌、食管腺癌，近年来，随着生活方式的改变，我国食管癌发病率逐年升高。由于食管癌早期发生迁移及侵袭导致病人术后生存率较低。钙激活的氯离子通道A4（Calcium-Activated Chloride Channel A4，CLCA4）在头颈部鳞状细胞癌中呈低表达，其低表达量与病人预后不良有关。相关报道指出CLCA4在结直肠癌中呈低表达并可能发挥抑癌基因作用。但CLCA4在食管癌发生及转移过程中的调控机制尚未可知。JAK激酶2/信号转导及转录激活蛋白3（JAK2/STAT3）信号通路可参与细胞增殖、凋亡、等生物学过程，肿瘤发生过程中该信号通路处于活化状态并可促进肿瘤发展进程。但CLCA4是否可通过调控JAK2/STAT3信号通路影响食管癌发生及转移过程尚未可知。本研究于2019年1月至2019年8月首先检测CLCA4在食管癌细胞系中的表达，选择表达最低的细胞系进行后续研究，探讨CLCA4过表达对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正常人食管鳞状上皮细胞Het-1A与人食管癌细胞KYSE170、Eca109、TE10均购自美国ATCC细胞库。结晶紫均购自陕西碧云天生物；BCA蛋白定量检测试剂盒、化学发光试剂ECL、十二烷基硫酸钠（SDS）购自美国Pierce；pcDNA3.1购自上海柯雷生物；JAK2/STAT3信号通路激活剂磷酸化JAK激酶2（p-JAK2）多肽购自上海吉尔；Lipofectamine2000与Trizol试剂购自美国Invitrogen；反转录试剂盒购自美国Promega；荧光定量PCR试剂盒购自美国ABI；Transwell小室购自美国Chemicon；Matrigel基质胶购自美国BD；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）购自齐一生物科技（上海）有限公司；兔抗人细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、依赖性激酶抑制因子（P21）抗体购自美国Santa Cruz；兔抗人基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）抗体购自厦门慧嘉生物科技有限公司；兔抗人JAK2、STAT3，p-JAK2、磷酸化信号转导及转录激活蛋白3（p-STAT3）抗体购自美国CST；二抗购自北京中杉金桥生物。

1.2 方法

1.2.1

实验处理与分组 分别将pcDNA-CLCA4、pcDNA-NC转染至Eca109细胞，分别记作CLCA4过表达（pcDNA-CLCA4）组、CLCA4阴性对照（pcDNANC）组，转染前1 d将培养液更换为Opti-MEM减血清培养基，转染6 h后将培养液更换为含有10%胎牛血清的DMEM新鲜培养基，继续培养48 h。将正常培养的Eca109细胞记作阴性对照（NC）组。后续实验分组：pcDNA-CLCA4组、p-JAK2多肽组（含有5µmol/L的p-JAK2多肽培养液培养Eca109细胞48 h）、pcDNA-CLCA4+p-JAK2多肽组（pcDNA-CLCA4转染至Eca109细胞48 h后，用含有5µmol/L的p-JAK2多肽培养液培养Eca109细胞48 h）。

1.2.2

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测细胞中CLCA4 mRNA表达水平 收集各组细胞，加入适量Trizol，室温静置5 min，依次加入氯仿与异丙醇，提取细胞总RNA。取2µg RNA进行反转录，按照试剂盒说明书配置反应体系，置于-20℃保存cDNA。RT-PCR反应扩增体系为20µL，按照试剂盒说明书配置反应体系，用2法计算CLCA4 mRNA相对表达量。

1.2.3

四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测细胞增殖 收集各组转染后食管癌Eca109细胞（3×10个/毫升）接种于96孔板（100微升/孔），每孔加入20µL MTT溶液，培养4 h后弃上清，每孔加入150µL DMSO，放入振荡仪匀速振荡10 min，应用酶标仪检测各孔相对吸光度（490 nm）。

1.2.4

Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 迁移实验：取各组Eca109细胞按照每孔200µL的密度加入上室，含有10%胎牛血清的培养液加入下室（600微升/孔），24 h后甲醛固定20 min，PBS洗涤，0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下观察并计数。侵袭实验：制备Matrigel基质胶稀释液加入上室（40微升/孔），后续实验步骤同迁移实验。

1.2.5

蛋白质印迹法（Western blotting）检测CLCA4、CyclinD1、P21、MMP-2、MMP-9、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达 提取细胞总蛋白，取50µg蛋白上样量加入1×SDS缓冲溶液，沸水中煮5 min（蛋白变性），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入目的蛋白一抗稀释液，4℃孵育24 h，加入相应二抗稀释液，室温孵育1 h，等渗缓冲盐溶液（TBST）洗涤，加入ECL化学发光剂，显影，定影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 CLCA4在正常人食管鳞状上皮细胞与人食管癌细胞中的表达

qRT-PCR与Western blotting检测结果显示，相较于正常人食管鳞状上皮细胞Het-1A，人食管癌细胞KYSE170、7E ca1809、TE10中CLCA4 mRNA及蛋白表达水平均显著降低（

P

＜0.05），其中CLCA4在食管癌Eca109细胞中的表达水平与其他细胞系比较明显降低，因而选用食管癌Eca109细胞进行后续研究。见图1、表1。

图1 CLCA4蛋白免疫印迹图

表1 钙激活的氯离子通道A4（CLCA4）在正常人食管鳞状上皮细胞Het-1A与人食管癌细胞KYSE170、Eca109、TE10中的表达/±s

2.2 CLCA4过表达对食管癌Eca109细胞增殖的影响

Western blotting检测结果显示，pcDNA-CLCA4组食管癌Eca109细胞中CLCA4蛋白相对表达量显著高于pcDNA-NC组（

P

＜0.05）。提示成功上调CLCA4的表达。MTT检测结果显示，与pcDNA-NC组相比，pcDNA-CLCA4组食管癌Eca109细胞存活率显著降低（

P

＜0.05），NC组与pcDNA-NC组比较差异无统计学意义（

P＞

0.05），见表2。与pcDNA-NC组比较，pcDNA-CLCA4组食管癌Eca109细胞中CyclinD1蛋白相对表达量显著降低（

P

＜0.05），P21蛋白相对表达量显著升高（

P

＜0.05）。见图2、表2。

图2 CLCA4蛋白与细胞增殖相关蛋白免疫印迹图

表2 CLCA4过表达对食管癌Eca109细胞增殖的影响/±s

2.3 CLCA4过表达对食管癌Eca109细胞迁移及侵袭的影响

pcDNA-CLCA4组迁移细胞数与侵袭细胞数均显著少于pcDNA-NC组（

P

＜0.05），MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量均低于pcDNA-NC组（

P

＜0.05），NC组与pcDNA-NC组比较差异无统计学意义（

P＞

0.05）。见表3、图3。

2.4 CLCA4过表达对JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达影响

Western blotting检测结果显示，pcDNA-CLCA4组食管癌Eca109细胞中p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均显著低于pcDNA-NC组（

P

＜0.05），而各组间JAK2、STAT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义（

P＞

0.05）。见图4、表4。

2.5 激活JAK2/STAT3信号通路可逆转CLCA4过表达对食管癌Eca109细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用

与pcDNA-CLCA4+p-JAK2多肽组比较，pcDNA-CLCA4组细胞存活率显著降低（

P

＜0.05），迁移细胞数与侵袭细胞数减少（

P

＜0.05）；与pcDNACLCA4+p-JAK2多肽组比较，p-JAK2多肽组细胞存活率升高（

P

＜0.05），迁移细胞数与侵袭细胞数增多（

P

＜0.05），见表5。与pcDNA-CLCA4+p-JAK2多肽组比较，pcDNA-CLCA4组食管癌Eca109细胞中p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量均降低（

P

＜0.05），P21蛋白水平升高（

P

＜0.05）；与pcDNA-CLCA4+p-JAK2多肽组比较，p-JAK2多肽组p-JAK2、p-STAT3、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高（

P

＜0.05），P21蛋白水平降低（

P

＜0.05）。见图5、表6。

表3 CLCA4过表达对食管癌Eca109细胞迁移及侵袭的影响/±s

图3 细胞迁移及侵袭相关蛋白免疫印迹图

图4 JAK2/STAT3信号通路相关蛋白免疫印迹图

表4 CLCA4过表达对JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响/±s

表5 激活JAK2/STAT3信号通路可逆转CLCA4过表达对食管癌Eca109细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用/±s

图5 JAK2/STAT3信号通路相关蛋白与细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白免疫印迹图

3 讨论

目前临床治疗食管癌已取得一定进展，但病人预后仍然很差，探究其根本原因在于食管癌细胞迁移及侵袭能力增强。既往研究显示食管癌发生发展过程涉及多种miRNA、基因等，但关于其具体作用机制尚未阐明。因而本研究积极探寻新型基因为食管癌靶向治疗提供潜在靶点。

CLCA4在结直肠癌、肝细胞癌、乳腺癌等肿瘤中呈低表达并可抑制细胞侵袭及迁移。但CLCA4在食管癌中的表达尚未可知。本研究结果显示CLCA4在食管癌细胞系中的表达水平明显降低，CLCA4过表达后可明显抑制食管癌细胞增殖、迁移及侵袭。研究表明CyclinD1可促进细胞周期由G1期进入S期，促进细胞增殖，而P21可抑制CyclinD1表达。MMP-2、MMP-9是基质金属蛋白酶类重要成员，可促进肿瘤细胞迁移及侵袭。本研究结果显示CLCA4过表达后可抑制食管癌细胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9的表达及促进P21的表达，提示CLCA4过表达可减弱食管癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

表6 JAK2/STAT3信号通路相关蛋白与细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达量/±s

JAK2/STAT3信号通路激活可抑制肝癌细胞凋亡，抑制该信号通路后肝癌细胞凋亡能力显著增强。研究表明吴茱萸碱可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活从而发挥抗结肠癌作用。相关报道指出抑制JAK2/STAT3信号通路激活可减弱鼻咽癌细胞迁移及侵袭能力。本研究结果显示CLCA4过表达后食管癌细胞中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平显著降低，用p-JAK2多肽激活JAK2/STAT3信号通路后，CLCA4过表达对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用明显减弱。

综上所述，CLCA4在食管癌细胞中呈低表达，CLCA4过表达后食管癌细胞增殖、迁移及侵袭能力降低，其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路有关，为食管癌靶向治疗提供新方向。但CLCA4对食管癌其他生物学特性及相关分子机制仍需进一步研究。