气质联用法研究多花黄精药材炮制过程中挥发性物质的变化

杜李继，陈瑞瑞，王 凯，陈世金*，陈龙胜*

气质联用法研究多花黄精药材炮制过程中挥发性物质的变化

杜李继1, 2，陈瑞瑞1, 2，王 凯2，陈世金1, 2*，陈龙胜1, 2*

(1. 安徽省科学技术研究院，合肥 230031；2. 安徽省植物活性成分提取分离工程技术研究中心，合肥 230088)

为比较多花黄精药材在炮制过程中挥发油化学组成及含量变化，探究炮制对多花黄精药材挥发性成分的影响，采用水蒸气蒸馏法对不同多花黄精药材炮制样品的挥发性成分进行提取，使用气相色谱质谱联用仪对挥发油化学组成进行分析，数据库对比分析多花黄精药材炮制前后的挥发性成分变化，并通过主成分分析法进行PCA得分分析。结果表明，挥发性成分中共鉴定出115种成分，炮制后小分子醛酮类挥发性物质含量明显降低，9次蒸晒炮制后有机酸成为主要挥发性成分，糠醛类等有害物质在炮制后含量升高，PCA得分显示多花黄精炮制过程中挥发性成分差异显著。可见传统炮制工艺对黄精的减毒增效有一定的效用，但因毒副产物的产生，炮制工艺应进一步优化。

多花黄精；炮制；挥发性成分；气质联用

黄精是我国传统中药，是百合科植物滇黄精Coll.et Hemsl、黄精Red和多花黄精Hua的干燥根茎[1]。

传统中医认为生黄精具有一定的刺激性，“久闻气味，有刺目之感”。对古代文献的统计分析结果显示，在检索到与黄精相关的34篇古代文献中有24篇论及黄精的炮制工艺或效用，涉及九蒸九晒炮制的文献有19篇[2]，古文献广泛认为需要通过炮制的过程来消除生黄精“刺人咽喉”的刺激性与毒副作用[3-4]。同时，炮制过程中其他物质的生成与变化也对黄精炮制产品效用研究提供参考，例如黄精多糖在炮制过程中发生糖苷键的水解和糖的脱水反应而生成5-羟甲基糖醛（5-HMF）。5-HMF虽具有防治神经退行性疾病等作用，但同时也存在一定生理毒性[5]。因此，如何做到去除刺激性气味的同时控制有害物质的生成，对多花黄精减毒增效、炮制工艺的优化提升等具有重要指示作用。作者以挥发性物质研究为切入点，以水蒸气蒸馏提取法提取蒸晒炮制后多花黄精挥发性成分[6]，并利用气质联用法对挥发性成分进行分析，探究炮制过程中挥发性物质的变化，为炮制工艺优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用的多花黄精药材采购于安徽池州膳粮黄精坊公司，由安徽省科学技术研究院刘玉军博士鉴定为多花黄精。

5977A-7890B气相色谱质谱联用仪(美国安捷伦公司)，MasshunterB07质谱软件工作站(美国安捷伦公司)，天平(德国Sartorius公司)，FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康公司)，组织捣碎机，挥发油测定器(四川蜀牛公司)，水(自制双蒸水)，色谱纯正己烷(德国Merk公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 多花黄精鲜药材委托安徽池州膳粮黄精坊公司参照传统九蒸九晒黄精炮制方法加工炮制。黄精样品洗净，去须根，整根黄精蒸制，以蒸气冒出开始计时，每次蒸制时间45 min，气温35 ℃以上晴天暴晒8 h，反复多次蒸晒即分别可得生晒样品、一蒸一晒、二蒸二晒、三蒸三晒、四蒸四晒、五蒸五晒、六蒸六晒、七蒸七晒、八蒸八晒和九蒸九晒共10种黄精炮制样品，并依次将其编号为S0、S1、S2…S9。炮制后的黄精样品切成厚度1.0 mm 左右薄片，切片以液氮急冻，在急冻状态下迅速用组织捣碎机将切片打碎，破碎时间20 s，将所得样品粗粉末立即放入真空干燥机冷冻干燥，冷冻干燥24 h后继续用研磨机研磨，所得细粉末过80目筛即得干燥样品粉末，4 ℃冷藏密封保存。

1.2.2 挥发油的制备 根据2015年版中国药典第四部[1]挥发油提取方法，准确称取样品粉末20.0 g，转移至烧瓶中，烧瓶中加水300 mL，连接挥发油测定器，从测定器上端加水充满收集管部分，然后再用移液管加入正己烷3.0 mL，连接冷凝装置。将烧瓶内容物加热至沸腾，保持沸腾，继续蒸馏，其速度以保持冷凝管的中部呈冷却状态为度，蒸馏6 h。蒸馏结束后取出收集管中上层液体定容，经无水硫酸钠除水后，过0.22 μm有机滤膜，共得到10个样品，冷冻储藏供GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS条件 仪器型号：安捷伦5977A-7890B软件：Masshunter B07版；

色谱柱：HP-5MS (30 m × 0.25 mm，0.25 µm) ；

进样口温度：250 ℃；载气：高纯氦气；流速1.0 mL·min-1；

进样方式：分流进样，分流比5∶1；进样量1.0 μL；

程序升温：平衡时间1 min，起始温度40 ℃，保持3 min，然后以7 ℃·min-1升至250 ℃并保持3 min；后运行：250 ℃保持3 min；

质谱条件：传输线温度250 ℃；离子源：EI源；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；扫描范围：30 ～ 500；溶剂延迟：4.1 min。

1.2.4 数据处理 采用NIST11 标准质谱图库进行数据检索，计算匹配分数大于80分鉴定结果，并采用峰面积归一化法计算样品中各组分的相对含量。部分特征性物质，以色谱峰面积对比炮制前后含量的变化。

采用IBM SPSS Statistics 22数据分析软件，以样品峰面积相对百分含量为特征值，将数据标准化后进行PCA分析。

2 结果与分析

2.1 炮制黄精挥发性成分分析

GC-MS分析10种炮制黄精挥发性成分的总离子流图（TCI）见图1。经过NIST11数据库比对，共鉴定出115种挥发性物质组份（表1）。

图1 10种炮制黄精样品挥发性成分GC-MS分析总离子流图

Figure 1 TIC of volatile components in 10 samples by GC-MS

通过图1中10种黄精样品总离子流色谱图之间的对比发现，炮制过程使样品中的低沸点挥发物质大幅降低，挥发性物质总量呈先下降后增长的趋势，S0样品总挥发性物质总量最多，S4样品总挥发性物质总量最少，S9挥发性物质总量仅次于S0，但其鉴定出的种类最少，仅有9种；S2样品鉴定出的挥发性成分种类最多，有47种。表1中列出了鉴定出115种挥发性物质，其中醇类11种，醛类32种，酮类12种，酸类7中，酯类7种，呋喃8种，这几种物质在炮制样品中的分布如图2所示。S7、S8和S9这3个样品的挥发性物质中出现的长链烷烃类物质，其异构体种类繁多，无法准确定性，未列入表1中。

在表1中醛类物质共鉴定出32种， S0中最多，醛类占S0总挥发性成分60.39%。随着蒸晒次数的增加，醛类物质含量下降明显，S9中仅含有4.43%。其中主要醛类物质正己醛（图3）含量急剧减少。在生晒黄精的挥发性成分中，正己醛是主要挥发性成分，占总挥发性成分的34.34%，其同样也是鲜黄精的挥发性成分中的主要成分[6]，是鲜黄精刺激性气味的来源之一。高浓度正己醛蒸气对眼睛、粘膜和上呼吸道有一定的刺激性，经过一次蒸晒的炮制即可去除大部分的正己醛，刺激性气味的祛除即是增效减毒的重要一步。而其他的一些挥发性香味物质，如具有豆香、果香、青香香气的2－正戊基呋喃和常用于香皂及化妆品中具有玫瑰香味的苯乙醛及其衍生物在炮制蒸晒的过程中含量降低明显。

表1 10种炮制黄精样品挥发性鉴定组分

续表1

图 2 10种样品挥发性成分中种类物质相对含量热图

Figure 2 Heat map of relative contents of volatile components in 10 samples

醇类物质在黄精的挥发性成分中种类和含量较少，共鉴定出11种醇类物质，S0样品中检测出4种，含量较低，仅占3.56%。炮制使得醇类物质种类和含量下降明显，S9中未检测出醇类物质。酮类物质鉴定出12种，含量呈现先上升后减少的趋势，S4中酮类物质含量最高，达到7.95%，主要成分为己酮。炮制过程造成醇、醛类物质氧化成酸类物质，酸类物质一共鉴定出7种，棕榈酸含量最多，特别是在S9样品中，相对含量达到44.78%，经过9次蒸晒炮制其含量提升幅度巨大（图3）。

黄精含糖量较高，在高温蒸制过程中会发生糖的热降解反应和美拉德反应，这两种反应均会产生5-羟甲基糠醛。5-羟甲基糠醛是中药材炮制过程中指标性副产物，有一定毒性副作用，5-羟甲基糠醛继续受热会分解产生5-甲基糠醛和糠醛[7]。有研究表明5-羟甲基糠醛含量随着多花黄精的炮制过程显著升高[8-9]，而本研究在GC-MS分析中未测出5-羟甲基糠醛，是由于5-羟甲基糠醛在GC高温进样口中发生热解，但发现5-甲基糠醛在多花黄精的炮制过程中含量显著上升，特别是在第9次蒸晒后，5-甲基糠醛含量的大幅提高，同时糠醛的含量也在炮制过程中快速升高(图4)。糠醛又称2-呋喃甲醛，属中等毒性类物质，其蒸汽具有强烈的刺激性，并有麻醉作用。糠醛类物质在体内不断积累会引起中毒，曾有过因连续食用某种龟苓膏引起胸口痛、呕吐、抽筋等症状[10]。5-甲基糠醛和糠醛含量的升高是由5-羟基甲基糠醛在大量产生后大量分解产生，这一结果也与5-羟基甲基糠在炮制过程中含量变化的研究结果相吻合[8]。因此，糠醛类毒副作用物质含量变化，对炮制工艺的优化“减毒增效”有着重要的参考价值。

图3 炮制过程中正己醛与棕榈酸含量变化

Figure 3 Changes of hexanal and palmitic acid contents during the processing

图4 炮制过程中糠醛和5-甲基糠醛的变化

Figure 4 Changes of furfural and 5-methylfurfural during the processing

此外，值得注意的是吲哚啉的出现。吲哚啉是一类非常重要的杂环骨架，其衍生物具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、神经保护、肝脏保护、镇痛、镇静等多种药理作用[11]。在多次的蒸晒之后，吲哚啉出现在挥发性成分中，S4样品中含量最高，达1.9%，但随着继续蒸晒炮制，含量又继续下降，S9样品中则已经消失。这说明在炮制过程中可能产生了吲哚啉及其衍生物，但又在后续的炮制中分解，虽然此类具有重要生理活性物质的出现对黄精及其炮制品药用价值的研究提供了新的启发与参考，但也意味着过度加工炮制也会带来有效成分的大量损失。

2.2 黄精炮制样品的PCA得分分析

10个黄精炮制样品的GC-MS数据经PCA分析后得分图（图5）显示，炮制过程能显著影响样品的PCA得分，10个样品的得分随着炮制次数的增加呈现出显著规律，样品在图中分部呈3个区域聚集，S0、S1、S2和S3小分子挥发性物质较多，在PC1因素得分较高。S4、S5在PC1和PC2因素的共同影响下得分非常接近。S6、S7、S8和S9在炮制后期受PC2因素影响较大。我们可以依照这种分布规律将炮制工艺分为炮制前期、炮制中期和炮制后期3个主要阶段，分阶段研究炮制工艺，对炮制工艺的改良优化具有指导意义。

图5 10个黄精炮制样品主成分分析得分图

Figure 5 PCA analysis scores of 10 samples

3 讨论

多花黄精具有健脾补肾、润肺生津等功效，为药食同源的道地皖药，安徽省池州、宣城、黄山等地都是多花黄精的独特产地和重要产区，其中九华黄精已成为国家地理标志产品[12]，相关产业快速发展。九蒸九晒作为古法炮制工艺尤受欢迎，但由于多花黄精含糖量高，在长时间的高温蒸制下，美拉德反应会产生烯醇、烯醛、酮等众多风味物质，这种独特风味可能同时也会潜藏着糠醛等有害物质。

古代文献对炮制黄精的记载多为“久服”或 “常服”[2]，长期食用的情况下如何将毒副作用有效控制，如何以最优化的炮制工艺在减毒的同时限制有害物质的产生是现代炮制工艺必须面对的课题。例如，5-羟甲基糠醛是否对健康存在潜在的危险有一定争议。 5-羟甲基糠醛主要来源于有两种，一是来源于氨基酸和还原糖发生美拉德反应，另外还会由糖的受热分解产生[13]。根据相关研究报道，5-羟甲基糠醛对人体横纹肌、内脏和神经等具有毒副作用，对眼睛、皮肤、上呼吸道及黏膜有刺激作用，并能与人体蛋白结合产生蓄积中毒，还可以诱导一定程度的染色体畸变和显著减缓有丝分裂活动[14]。但从剂量的角度而言，5-羟甲基糠醛只有在较高的浓度下才呈弱毒性，若在正常摄入量的范围内并不存在显著的健康风险。有研究通过各种动物实验证明了5-羟甲基糠醛每天摄入量在 80 ～100 mg·kg-1范围内并未发现有健康危害[15]。因此，通过控制炮制过程中蒸制温度与时间，优化加工工艺，控制此类物质的大量生成，在避免大剂量长期食用的情况下，健康风险是可控的。

此外，本研究发现九蒸九晒后的多花黄精，作为刺激性气味来源的醛类物质消失，而炮制过中可能出现的吲哚啉类等其他活性物质在九蒸九晒样品里没有再出现。推测是否存在着九蒸九晒过度高温蒸制引起活性物质损失的可能，同时可否通过控制每次蒸制或总蒸制的时间与温度来减少糠醛类物质产生[16]。因此，结合PCA主成分分析结果，以挥发性或其他标志性生物活性成分的含量为参考，开发出更加优化的炮制工艺，值得进一步探究。

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Changes of volatile substances in rhizome ofprocessing by GC-MS

DU Liji1, 2, CHEN Ruirui1, 2, WANG Kai2, CHEN Shijin1, 2, CHEN Longsheng1, 2

(1. Anhui Academy Science and Technology, Hefei 230031;2. Anhui Engineering Research Center for Plant Active Component Extraction and Separation, Hefei 230088)

To observe the composition and content changes of volatile oil in rhizome ofprocessing, and evaluate the effect of processing on the volatile components of processed, we extracted the volatile oil with steam distillation from each processed sample, analyzed its chemical composition by GC-MS (gas chromatography- mass spectrometry) and the changes of its volatile component before and after processing by database comparison and principal component analysis. The result showed: 115 components were identified in the volatile oil, the contents of small molecular aldehydes and ketones volatile substances had significantly reduced after processing, and organic acid became the main volatile component after steaming and drying for nine times, while harmful substances such as furfural increased after processing, and indoline active substances also appeared. PCA scoring showed that the volatile components were significantly different during the processing. In conclusion, the traditional processing plays a certain role in reducing toxicity and increasing efficacy of, but the processing technology should be further optimized due to the accumulation of toxic byproduct.

; processing; volatile components; GC-MS

R282.710.2

A

1672-352X (2021)06-1035-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.017

2022-1-6 20:52:15

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1254.034.html

2020-10-28

安徽省科技重大专项(17030801026)，安徽省2020年度中央引导地方科技发展专项(202007d06020007)，2020年安徽省博士后研究人员科研活动经费项目(2020A396)和黄山市科技计划项目(2018KN-08)共同资助。

共同第一作者:杜李继，助理研究员。E-mail：leonardo1317@163.com 陈瑞瑞，助理研究员。E-mail：906537150@qq.com

通信作者:陈世金，助理研究员。E-mail：jj.1235812@163.com 陈龙胜，研究员。E-mail：formatsky@tom.com