苦参凝胶对大鼠细菌性阴道炎阴道黏膜SDF-1/CXCR4轴的影响

向丽 曹丽蓉 王中显 黄浩梁 王平

(武汉市第一医院妇产科，湖北 武汉 430000)

细菌性阴道炎在妇科临床中为常见病及多发病，大多是细菌感染所致〔1〕，患者出现外阴瘙痒、白带增多、阴道分泌物异常等症状，病情严重者会导致宫颈炎、附件炎等并发症，严重影响妇女的身心健康〔2〕。苦参凝胶的有效成分主要为苦参碱，是纯中药制剂，可杀虫止痒、清热利湿〔3〕，临床中常用来治疗慢性妇科炎症，可恢复阴道内环境，改善其微生态平衡，进而减轻细菌性阴道炎患者的临床症状，降低其复发率〔4〕。基质细胞衍生因子(SDF)-1是一种炎性趋化因子，CXC趋化因子受体(CXCR)4是其受体，在多种细胞和组织中广泛表达，介导细胞募集、迁移、增殖等生理活动〔5〕，另外研究发现SDF-1/CXCR4轴在炎症反应中起到重要的调节作用，外源性SDF-1可引起骨性关节炎，下调SDF-1/CXCR4表达，可减轻炎症反应，延缓牙龈卟啉单胞菌诱导的牙周炎病情进程〔6〕，因而推测SDF-1/CXCR4轴可介导细菌性阴道炎。研究表明，苦参碱可抑制人胃癌细胞SGC-7901中CXCR4 mRNA表达，并诱导其凋亡〔7〕，在对HL-60细胞体外迁移研究中发现，复方苦参注射液可通过上调miR-146a表达而抑制SDF-1/CXCR4信号通路，进而减弱其迁移能力〔8〕，但在细菌性阴道炎中，SDF-1/CXCR4的表达及苦参凝胶对其的作用，目前还未有明确报道，本文探讨苦参凝胶处理对细菌性阴道炎大鼠阴道黏膜SDF-1/CXCR4轴的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级Wistar大鼠购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号SCXK(湘) 2019-0013，使用许可证号SCXK(湘) 2019-0013，雌性，体重180～220 g，饲养于医院动物中心，动物房温度设置为25℃，相对湿度设置为55%，噪音低于80 dB，自然光照、氨浓度小于20 ppm，气流速度10～25 cm/s，每小时通风换气8～12次，自然饮食、饮水，定期更换垫料，清洗、消毒鼠笼。

1.2主要药品及试剂 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌(批号：25923、25922、27853)购自美国ATCC公司；苦参凝胶(国药准字 Z20050058，每支5 g，批号：180127)购自贵阳新天药业股份有限公司；氧氟沙星栓(批号：180312)购自江西吉安三力制药有限公司；营养肉汤培养基(批号：BS1007)购自青岛捷世康生物科技有限公司；血琼脂培养基(批号：WD-0131)购自上海榕柏生物技术有限公司；羊抗兔二抗、兔源anti-CXCR4一抗、兔源anti-GAPDH一抗、兔源anti-SDF-1一抗、大鼠白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α ELISA试剂盒(批号：ab150077、ab197203、ab181602、ab9797、ab100772、ab100785)购自Abcam公司；SDF-1、CXCR4、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒(批号：9108、9014、9519)购自Takara公司；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(批号ZY7070)购自上海泽叶生物科技有限公司；RIPA裂解液(批号GL1476)购自北京百奥莱博科技有限公司；BCA试剂盒(批号：LCB004)购自上海榕柏生物技术有限公司。

1.3主要实验仪器 DNA合成仪(型号MerMade-192E)购自北京梓熙生物科技有限公司；多功能酶标仪、荧光定量PCR仪(型号VARIOSKANLUX、QuantStudio 3)购自美国Thermo Fisher Scientific公司；转膜仪、蛋白电泳仪(型号：Trans-Blot SD、1659001)购自美国Bio-Rad公司；实验室教学生物显微镜(型号Eclipse E200)购自日本尼康公司；石蜡切片机(型号RM2235)购自德国Leica公司；化学发光凝胶成像系统(型号JS-1090P)购自上海培清科技有限公司。

1.4方法

1.4.1细菌性阴道炎大鼠模型建立及分组给药 感染菌液的制备〔9〕：将葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌3种菌株复苏后以无菌营养肉汤培养、传代，并配制浓度为2.0 × 109个/ml的菌液，接着将3种菌液按1∶1∶1的比例混合成感染菌液备用。

参照文献〔10〕：以45 mg/kg的剂量腹腔注射2.5%戊巴比妥钠麻醉大鼠，在无菌操作台中摘除大鼠双侧卵巢，术后第4天开始每天以10 mg/kg的剂量皮下注射苯甲酸雌二醇，持续4 d后，以60 mg/kg的剂量皮下注射氢化可的松注射液，隔日1次，持续3 d，复制大鼠免疫功能低下模型。2 d后将50 μl感染菌液注入大鼠阴道内，提起大鼠尾部停留约2 min，防止菌液溢出，1 d后以相同方法再感染1次，然后隔日交替皮下注射苯甲酸雌二醇、氢化可的松注射液各1次，建模结束后观察大鼠外阴情况，若呈现肿胀发红，并有白色分泌物渗出，取少量分泌物涂布在血琼脂培养基，在37℃下培养，72 h后肉眼观察到培养基上分布有大小不等的菌落，则表明模型建立成功，共成功建立模型大鼠60只，随机分为模型组、氧氟沙星栓剂(0.02 g/kg)组、苦参凝胶低(0.25 g/kg)、中(0.50 g/kg)、高(1.00 g/kg)剂量组，每组12只，另取12只设为假手术组，只进行手术操作，不摘除卵巢，大鼠阴道内注入50 μl无菌营养肉汤，其他操作同模型组。参照文献，苦参凝胶低、中、高剂量组分别以0.25、0.50、1.00 g/kg的剂量阴道内给药〔11〕，氧氟沙星栓剂组以0.02 g/kg的剂量阴道内给药〔9〕，模型组和假手术组大鼠阴道内置入等体积的赋形剂，持续7 d。

1.4.2大鼠阴道分泌物细菌转阴率检测 末次给药24 h后，各组大鼠以无菌棉棒分别取阴道分泌物，涂抹在血琼脂培养基上(无菌操作)，放置在37℃培养箱中培养，24 h后肉眼观察是否出现菌落，连续两次检测均无细胞菌落出现，表示转阴。转阴率计算公式如下：转阴率=出现细菌移位的大鼠数/各组大鼠总数(12)×100%。

1.4.3标本采集及HE染色 末次给药24 h后，各组大鼠分别自尾静脉每只采血1.5 ml，3 000 r/min，4℃下离心15 min后吸出上清液(血清)，置于Ep管中，保存在-80℃的冰箱中。以乙醚麻醉各组大鼠，随后处死，分离并取下阴道黏膜组织，每只大鼠各取约1 g黏膜组织，保存于液氮中，剩余组织采用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，以滤纸吸干，置于10%甲醛溶液固定24 h，使用80%、90%、95%、100%的乙醇溶液依次脱水1.5 h，用透明剂二甲苯孵育2 h透明后，采用石蜡包埋组织块，最后放入切片机中切片，选出完整、厚薄均匀的切片，使用二甲苯去除其中的石蜡，依次放入100%、95%、90%、80%的乙醇溶液中处理后转移到蒸馏水中浸泡漂洗，按照试剂盒说明书的指导步骤做HE染色，然后将切片按上述操作方法再次脱水、透明后封片。

1.4.4大鼠阴道黏膜组织损伤情况检测1.4.2中的阴道黏膜组织HE染色后的切片镜下观察并拍照，根据阴道黏膜组织平整度、下层、肌层等充血、水肿、炎性细胞浸润等病理改变情况，对其炎症程度进行评分，镜下见：阴道黏膜平滑，无充血肿胀症状评为0分；镜下见：阴道黏膜尚平滑，有轻度充血肿胀症状评为1分；镜下见：阴道黏膜尚平滑，有中度充血肿胀症状，并出现点状出血点评为2分；镜下见：阴道黏膜不平滑，有重度充血肿胀症状，出现大量出血点评为3分。

1.4.5大鼠血清TNF-α、IL-6水平检测 取出1.4.3中保存的血清在4℃下解冻，按照ELISA试剂盒说明书步骤测定血清TNF-α和IL-6水平。

1.4.6大鼠阴道黏膜组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平检测 取0.5 g1.4.3中冻存的阴道黏膜组织在研钵中研碎，按照说明书的指导步骤做以RNAiso Plus提取其中总RNA，然后将其按照逆转录试剂盒说明书的指导步骤逆转录为cDNA，采用qRT-PCR检测各组大鼠阴道黏膜组织中SDF-1和CXCR4 mRNA水平，按照荧光定量试剂盒说明书的指导配制反应体系，并设定反应条件，内参基因选择GADPH，通过2-ΔΔCt算法对所得数据进行分析。qRT-PCR引物序列：SDF-1：正义链：5'-GCATTGACCCGAAGCTAAAG-3'，反义链:5'-ACACACACACCTGGTCCTCA-3'，CXCR4：正义链：5'-GAGAAGCATGACGGACGGACAAGTA-3'，反义链：5'-GCAAAGATGAAGTCGGGAATAG-5'，GADPH：正义链：5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3';反义链：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG。

1.4.7大鼠阴道黏膜组织中SDF-1、CXCR4蛋白水平检测1.4.3中剩余的约0.5 g冻存组织，加入含有一定浓度蛋白酶抑制剂的裂解液，冰水浴中匀浆，将匀浆液放入4℃离心机中，于3 000 r/min下离心20 min，按照二喹啉甲酸(BCA)试剂盒说明书的指导步骤测定上清液中蛋白总浓度并根据测定结果调整蛋白样本为相同浓度，配制适宜浓度的十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)浓缩胶、分离胶，蛋白样本变性煮沸后，进行电泳使蛋白分离，接着湿转，使蛋白转移至硝酸纤维膜，以5%的脱脂奶粉室温孵育硝酸纤维膜2 h，封闭膜上蛋白，根据分子量剪下目的蛋白条带，分别使用兔源anti-GAPDH一抗、兔源anti-CXCR4一抗、兔源anti-SDF-1一抗4℃孵育蛋白条带过夜，TBST溶液洗膜后使用羊抗兔二抗室温孵育2 h，TBST再次洗膜后，采用ECL法显色，在凝胶成像仪中观察蛋白表达并采集图像，以Image-Pro plus 软件分析图像灰度值。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0软件进行χ2检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1苦参凝胶对阴道黏膜组织病理形态的影响 与假手术组〔炎症评分〔(0.36±0.04)分〕相比，模型组阴道黏膜组织水肿、炎症细胞浸润、出血破溃，黏膜不平滑，炎症评分〔(2.83±0.11)分〕显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，药物处理组〔苦参凝胶低、中、高剂量组炎症评分为(2.08±0.09)分、(1.72±0.08)分、(0.55±0.05)分；氧氟沙星栓剂炎症评分为(0.54±0.03)分〕，阴道黏膜组织上述病理症状减轻，炎症评分均显著降低，且苦参凝胶各组之间呈剂量依赖性作用，差异有统计学意义(P<0.05)；苦参凝胶高剂量组和氧氟沙星栓剂组相比，大鼠阴道黏膜组织上述病理症状减轻程度相似，炎症评分差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组阴道黏膜组织病理形态(HE，×200)

2.2苦参凝胶对阴道中细菌转阴率的影响 模型组大鼠阴道中细菌转阴率为0；与模型组相比，药物处理组大鼠阴道中细菌转阴率显著升高，且苦参凝胶各组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；苦参凝胶高剂量组和氧氟沙星栓剂组相比，大鼠阴道中细菌转阴率差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 苦参凝胶对大鼠阴道中细菌转阴率的影响〔n(%),n=12〕

2.3苦参凝胶对大鼠血清IL-6和TNF-α水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠血清IL-6和TNF-α水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，药物处理组大鼠血清IL-6和TNF-α水平降低，且苦参凝胶各组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；苦参凝胶高剂量组和氧氟沙星栓剂组相比，大鼠血清IL-6和TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比较

2.4苦参凝胶对大鼠阴道黏膜组织SDF-1和CXCR4 mRNA水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠阴道黏膜组织中SDF-1和CXCR4 mRNA水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，药物处理组大鼠阴道黏膜组织中SDF-1和CXCR4 mRNA水平降低，且苦参凝胶各组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；苦参凝胶高剂量组和氧氟沙星栓剂组相比，大鼠阴道黏膜组织中SDF-1和CXCR4 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠阴道黏膜组织中SDF-1、CXCR4 mRNA水平比较

2.5苦参凝胶对大鼠阴道黏膜组织中SDF-1和CXCR4 蛋白水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠阴道黏膜组织中SDF-1和CXCR4 蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，药物处理组大鼠阴道黏膜组织中SDF-1和CXCR4 蛋白表达降低，且苦参凝胶各组之间呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；苦参凝胶高剂量组和氧氟沙星栓剂组相比，大鼠阴道黏膜组织中SDF-1和CXCR4 蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表4。

1～6：假手术组；模型组；苦参凝胶低剂量组；苦参凝胶中剂量组；苦参凝胶高剂量组；氧氟沙星栓剂组图2 Western印迹检测各组阴道黏膜组织SDF-1、CXCR4 蛋白表达

表4 各组大鼠黏膜组织中SDF-1、CXCR4 蛋白水平比较

3 讨 论

阴道炎是妇科最常见的下生殖道感染性疾病，女性患病率约为18%，是各种阴道黏膜炎性疾病的总称，其中细菌性阴道炎约占40%，近年来我国妇女发病率呈增长趋势，严重影响女性的生殖健康〔13，14〕。细菌性阴道炎大多是感染葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等多种细菌引起，在中医上属于阴痒、带下病范畴，由脾虚生湿，湿热下注，邪毒内侵，外阴不洁、湿蕴生虫等所致，以清热解毒，除湿止痒为治疗原则〔15〕，苦参作为我国传统中药，性寒味苦，具有清热解毒、祛风杀虫、燥湿利尿等多种功效，在临床上可用来治疗多种妇科炎症〔16〕，苦参凝胶是一种药物赋形剂，有效成分为苦参总碱，研究表明，可用来治疗细菌性阴道炎，和甲硝唑片联合应用可降低其阳性率及复发率，提高临床治疗效果〔17〕。本研究结果表明葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌可引起细菌性阴道炎，使大鼠发生炎症反应，导致阴道黏膜出现充血、水肿、炎性细胞浸润等症状，阴道内给药治疗可杀灭细菌，减轻炎症反应，修复阴道黏膜功能，进一步证明了其对细菌性阴道炎的治疗作用。

SDF-1对炎性细胞活化和迁移起到重要的调节作用，进而介导机体炎症反应，研究发现在心肌梗死病理过程中SDF-1/CXCR4 轴被激活，其对心肌梗死的病情发展具有重要的调节作用〔18〕。另外SDF-1/CXCR4在类风湿关节炎患者外周血中高表达，可调节病情的进展〔19〕，而苦参可调节SDF-1/CXCR4 轴的激活，薛天阳等〔20〕发现苦参碱可抑制体外培养人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞CXCR4 mRNA表达，进而诱导细胞凋亡，因此可推测下调SDF-1/CXCR4 轴，可能是苦参凝胶治疗细菌性阴道炎的药理机制之一。本研究表明苦参凝胶可下调细菌性阴道炎大鼠阴道黏膜组织中SDF-1及CXCR4表达，揭示苦参凝胶治疗细菌性阴道炎的药理机制之一可能是下调SDF-1/CXCR4通路。

综上所述，苦参凝胶能杀灭致病菌，降低大鼠炎症反应，修复阴道黏膜功能，对治疗细菌性阴道炎具有较好的疗效，下调SDF-1及CXCR4信号通路可能是其作用机制之一。本研究证实了苦参凝胶对细菌性阴道炎的治疗作用，并对SDF-1/CXCR4 轴在其中的作用进行了初步探索，但更确切的分子机制未涉及，还需要进一步研究。