CD147通过促进糖酵解活化肝星状细胞

李海燕 杨丽丽 郭璞 柴娟

(1西安医学院医学技术学院，陕西 西安 710000；2西安市中医医院肛肠科；3 西安医学院口腔学院)

肝纤维化是在各种类型慢性肝损伤病因作用下，肝脏组织发生的一种损伤修复反应,其主要特点是细胞外基质(ECM)过度沉积〔1〕。若肝纤维化得不到有效控制，最终会进展为肝硬化，甚至肝癌。ECM的主要来源是活化的肝星状细胞(HSC)，因此HSC的活化是肝纤维化病理机制中的核心事件〔2〕，但关键分子机制尚不明确。CD147 属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员，以往研究中CD147在肝纤维化组织中高表达，并在HSC活化中发挥重要作用，其功能与糖代谢有一定相关性〔3〕。而已有研究发现，在肝纤维化的病理过程中，活化的HSC依赖于糖酵解供能〔4〕。本研究旨在探讨糖酵解是否在HSC活化中发挥了重要作用及CD147是否通过糖酵解作用活化HSC，从而对肝纤维化发生发展的机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞和试剂 人HSC系LX-2由中科院上海细胞库提供； CD147 siRNA(上海吉玛制药技术有限公司)、转化生长因子(TGF)-β1(美国 Sigma公司)、Galloflavin(美国 Sigma公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国 Pierce公司)、乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒(美国 Peprotech公司)，鼠抗人CD147、α-平滑肌动蛋白(SMA)、α-tubulin抗体(美国 Abcam公司)。

1.2转染LX-2细胞系细胞培养及si-CD147 转染细胞 将LX-2细胞接种于6孔板(2×105个细胞/ml)，孵育于10% 胎牛血清的 RPMI1640培养基，放置于5% CO2恒温培养箱(37℃)。转染前以无血清培养液饥饿24 h，将si-CD147转染入对数生长期LX-2细胞，阴性对照组转染snc-RNA。转染步骤按照LipofectamineTM2000脂质转染试剂盒说明书操作。

1.3LX-2细胞处理及分组 为了验证CD147及糖酵解在HSC的表达，选取对数生长期LX-2细胞，以无血清培养基饥饿过夜后，分别以不同浓度TGF-β1(1、2、4 ng/ml)作用于LX-2细胞，空白对照组为不加任何刺激的LX-2细胞。为了验证糖酵解对HSC活化的作用，以糖酵解抑制剂Galloflavin(20 μmol/L)和TGF-β1(4 ng/ml)作用于饥饿后的LX-2细胞，分为TGF-β1(4 ng/ml)组、Galloflavin(20 μmol/L)+ TGF-β1(4 ng/ml)组。为了验证CD147通过糖酵解促进HSC活化，以TGF-β1(4 ng/ml)、si-CD147作用于饥饿后的LX-2细胞，分为空白组、TGF-β1组、TGF-β1+ snc-RNA组、TGF-β1+ si-CD147组。

1.4Western印迹 清洗细胞后，以RIPA裂解细胞，BCA法对所提取的总蛋白定量。上样后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白转聚偏氟乙烯(PVDF)膜封闭，洗膜后与特异一抗孵育，4℃过夜，PBST洗膜后孵育二抗，室温放置1 h，洗膜，电化学发光液显影，凝胶成像分析系统分析蛋白条带。

1.5LDH活性检测 以浓度0.25%胰酶消化各组LX-2细胞，冰浴超声破碎细胞后离心，收集细胞上清液。严格按照LDH活性检测试剂盒说明书操作，检测各孔吸光度值。LDH活性=测定管吸光度值/(标准管吸光度-空白管吸光度值)×标准浓度/样品蛋白浓度。

1.6统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1活化的HSC中CD147蛋白表达 空白组、TGF-β1处理组(1、2、4 ng/ml)LX-2细胞中CD147的蛋白表达分别为(1.00±0.00)、(2.10±0.19)、(4.21±0.31)、(5.71±0.39)；α-SMA蛋白表达分别为(1.00±0.00)、(2.27±0.20)、(3.53±0.19)、(4.14±0.27)。CD147、α-SMA蛋白表达与TGF-β1的剂量呈正相关,均显著高于空白组(P<0.01)。见图1。

图1 不同浓度TGF-β1作用于HSC，CD147和α-SMA的蛋白表达

2.2活化HSC中糖酵解相关酶的活性 空白组、TGF-β1处理组(1、2、4 ng/ml)LX-2细胞中LDH的活性分别为(90.184±64.417)、(1 024.540±88.427)、(1 230.061±73.811)、(1 601.227±80.225)U/gprot，细胞内LDH活性与TGF-β1的剂量呈正相关，均显著高于空白组(P<0.01)。

2.3抑制糖酵解对HSC活化的影响 TGF-β1+Galloflavin组中α-SMA蛋白表达(1.00±0.00)显著低于空白组(4.15±0.23，P<0.01)，见图2。

图2 糖酵解抑制剂Galloflavin作用于活化HSCα-SMA的蛋白表达

2.4敲减CD147对HSC糖酵解的影响 空白组TGF-β1(4 ng/ml)、si-CD147处理LX-2细胞后，检测各组细胞内LDH的活性。空白组LX-2细胞中LDH活性为(738.710±31.109)U/gprot，TGF-β1+ snc-RNA组〔(1 612.903±104.379)U/gprot〕与TGF-β1组〔(1 658.065±82.305)U/gprot〕差异无统计学意义(P>0.05)，而TGF-β1+ si-CD147组〔(1 151.613±67.047)U/gprot〕显著低于TGF-β1组和TGF-β1+sncRNA组(P<0.01)。

2.5敲减CD147对HSC活化的影响 TGF-β1+ snc-RNA组与TGF-β1组中CD147(5.16±0.41，5.05±0.39)和α-SMA蛋白表达(4.76±0.33，4.66±0.36)差异无统计学意义(P>0.05)，而TGF-β1+ si-CD147组(1.80±0.07，2.19±0.77)明显低于上述两组(P<0.01)。见图3。

图3 敲减CD147后，活化肝星状细胞中CD147和α-SMA的蛋白表达

3 讨 论

肝纤维化是肝炎进展为肝硬化、肝癌的必经阶段，更是“肝炎→肝纤维化→肝癌”炎-癌链的枢纽〔3〕。因此遏制肝纤维化进展为肝硬化、肝癌已经成为提高患者生存率及生存质量刻不容缓的课题。HSC被公认为肝纤维化进程中最关键的效应细胞〔4〕。虽然有关HSC活化的研究已有很多，但其具体活化机制尚未被完全阐明，启动HSC活化的关键分子及其作用也未被完全揭示。

糖酵解是细胞在无氧条件下获得能量的途径，肿瘤细胞的生长依赖于糖酵解而不是氧化磷酸化反应，这个现象称为“Warburg”效应〔5〕。与此相似的是，HSC活化后具有很强的增殖能力，活化后数量增多，导致ECM分泌量增加，加速了肝纤维化的进程。最近研究发现，HSC活化过程中细胞内发生了能量代谢方式的转变，即由线粒体氧化磷酸化途径转变为无氧糖酵解途径，类似于肿瘤细胞中发现的“Warburg”效应〔6～8〕，因而，通过阻断糖酵解途径切断HSC的能量供应，从而抑制HSC活化可能是抗肝纤维化的新策略。

CD147 属于IgSF成员，研究表明CD147分子在肝癌中显著高表达，并与肝癌细胞的增殖、凋亡、运动及侵袭转移密切相关〔9～11〕。多项研究证明，CD147通过各种机制促进肝癌细胞的糖酵解进而促进肝癌生长，如CD147 分子可与负责乳酸转运的MCT 家族分子相互作用促进肝癌细胞糖酵解〔12,13〕；CD147 通过PI3K/Akt 信号通路上调葡萄糖转运蛋白(Glut1)的表达，磷酸果糖激酶(PFK)的活性促进肝癌细胞糖酵解〔12〕。已有研究表明，CD147在尚未进展为肝癌的肝硬化组织中显著高表达，但其在肝纤维化、肝硬化发生发展中发挥的病理生理功能尚不明确〔14〕。本研究结果表明CD147表达与HSC的活化程度呈正相关。且糖酵解作用与HSC的活化程度呈正相关。另外，本研究结果表明，在HSC活化过程中，抑制其糖酵解可以下调其活化程度。而且，抑制CD147的表达可以抑制糖酵解作用从而下调HSC的活化程度。本研究从糖代谢的角度探索了肝纤维化发生发展机制，但CD147上调糖酵解，促进HSC活化的具体分子机制尚需进一步的实验研究。此外，本研究主要观测了体外HSC的培养体系，进一步的体内实验验证将成为本课题组的下一步工作。