HSF1及Akt在三阴性乳腺癌的表达及意义

唐玮 王翠芳 金丹 王士娜

(沈阳医学院 1基础医学院研究生院，辽宁 沈阳 110034；2附属中心医院病理科)

乳腺癌是最常见的危害女性健康的恶性肿瘤之一，死亡率近年来呈上升趋势〔1〕。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种特殊的乳腺癌分型，其雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体(HER)2均表现为阴性，因其恶性程度高、易转移、易复发等特点，长期以来缺乏特异有效的治疗方法，为寻求一种有效的治疗方法成为近年来的研究热点〔2～4〕。热休克转录因子(HSF)1与肿瘤的侵袭转移及病情发生发展有密切关系。蛋白激酶B(Akt)在细胞存活和凋亡中至关重要，对细胞代谢、细胞增殖、细胞周期等多种生物学行为进行调控。目前有很多关于HSF1与其他癌症关系的研究〔5，6〕报道，例如肝癌、肺癌、子宫内膜癌等，但HSF1及Akt与三阴性乳腺癌的关系的研究尚少，本研究旨在探讨HSF1及Akt在三阴性乳腺癌组织中的表达及其与临床病理学特征的关系。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取沈阳医学院附属中心医院病理科2010年1月至2018年12月经手术切除证实为TNBC的蜡块标本64例为研究对象，同时取来自相同患者的癌旁组织标本作为对照组，所有病例经两位病理科医师同时确诊。患者年龄27～79岁，中位年龄56岁；所有病例术前未接受放化疗。

1.2主要试剂 一抗〔HSF1 Rabbit Ab和Akt(pan)(C67E7) Rabbit mAb〕购自Cell Signaling TECHNOLOGY、二抗(酶标羊抗小鼠兔IgG聚合物)购自福州迈新生物技术开发有限公司、粉剂型磷酸盐缓冲液(PBS)、内源性过氧化物酶购自福州迈新生物技术开发有限公司、二氨基联苯胺(DAB)染色液(聚合物法)购自福州迈新生物技术开发有限公司、抗原修复液(pH9.0)购自上海基因科技有限公司。

2017年1月，国家能源局印发的《能源技术创新十三五规划》中指出：“十三五期间重点研究 8 MW～10 MW等级及以上的超大型海上风电机组关键技术。降低海上风电场的度电成本，实现5 MW～6 MW等级大型海上风电机组安装规范化和机组运维智能化”。作为国家战略性新兴产业的重要内容，海上风电已成为风电产业发展的技术制高点，并逐渐成为世界风电产业发展的主要方向。

1.3EnVision两步法进行免疫组织化学染色 手术肿物切除后使用10%甲醛固定，取材，石蜡包埋，4 μm切片，切好的片80℃烤箱烘烤1 h，石蜡脱水，乙二胺四乙酸(EDTA)(1∶50)高温高压修复，自然冷却40 min，切片放在湿盒上，用滤纸擦干水渍，油笔圈出待测组织区域，之后PBS洗3次、每次3 min，使用内源性过氧化物酶3% H2O2阻断剂、室温孵育10 min，PBS洗3次、每次3 min，每张切片滴加50 μl 1∶200浓度的一抗HSF1或Akt、4℃孵育过夜。第二天，室温放置30 min后，PBS洗3次、每次3 min，每张切片滴加50 μl二抗、室温孵育15 min，PBS洗3次、每次3 min，每张切片滴加足够量新鲜配置的DAB显色液、显色3～6 min，自来水冲洗，苏木素复染10 s，自来水冲洗返蓝，无水酒精脱水10 min，中性树胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性标本切片作为阳性对照。光镜下观察。

2.3 通过探究与拓展，激发“深度学习” 在小组合作中的探究学习能够让学生敞开心扉，像专业人员一样主动发现问题并积极地解决问题，在课堂教学中让学生沿着科学家探索的足迹，回到那个年代，模拟科学家的思维进行过程探究，不知不觉中学生走向了“深度学习”。

2.2HSF1及Akt在TNBC组织中的表达与临床病理参数的关系 HSF1阳性表达与肿瘤直径及淋巴结转移相关(P<0.05)，且肿瘤直径越大，阳性率越高，而与年龄及组织学分级无关；Akt阳性表达与肿瘤直径及组织学分级相关(P<0.05)，且肿瘤直径越大，阳性率越高；组织学分级越高，阳性率越高，而与年龄及淋巴结转移无关。见表1。

2.1HSF1及Akt在TNBC组织中的表达 HSF1阳性表达部位主要定位在细胞核，Akt阳性表达部位主要定位在细胞质，见图1。HSF1在TNBC组织中阳性表达率〔71.88%(46/64)〕明显高于癌旁对照组〔10.94%(7/64);χ2=48.978，P=0.000〕；Akt在TNBC组织中阳性表达率〔73.44%(47/64)〕明显高于癌旁对照组〔9.38%(6/64);χ2=51.822，P=0.000〕。

1.5统计学处理 采用SPSS20.0软件行χ2检验及Spearman相关分析。

2 结 果

基于互联网数据的大学生“中国梦”教育的关键因素研究及教育路径研究..................................................................................................................................王浩业 颜吾佴（58）

图1 HSF1及Akt在TNBC组织中的表达情况(DAB，×10)

1.4结果判读 HSF1的阳性表达为细胞核呈棕黄色颗粒，Akt的阳性表达为细胞质呈棕黄色。结果判读采用双盲法，由两位资深病理医生进行读片评分。免疫组织化学染色结果判读标准分两方面：根据染色强度分为4级：不显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分；根据染色面积分为5级：面积≤ 5% 为0分，面积6%～25% 为1分，面积26% ～ 50% 为2分，面积51% ～ 75% 为3分，面积>75% 为4分。最后将染色强度及染色面积所得分数相乘，0分为阴性(-)，1 ～ 4分为弱阳性(+)，5～9分为中阳性()，>9分为强阳性()〔7〕。

表1 HSF1及Akt表达与临床病理参数的关系(n)

2.3HSF1及Akt相关性分析 HSF1及Akt共同阳性表达43例，共同阴性表达14例，HSF1阳性表达而Akt阴性表达3例，HSF1阴性表达而Akt阳性表达4例。HSF1与Akt表达呈正相关(r=0.725，P=0.000)。

3 讨 论

TNBC是一种异质性肿瘤，异质性是恶性肿瘤的特征之一，肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性及预后等各方面存在差异，同一肿瘤中可以存在不同的基因型或亚型的细胞，同一肿瘤在不同的个体身上可以表现出不一样的治疗效果及预后，甚至同一个体身上的肿瘤细胞也存在不同的特性和差异〔8，9〕。十年以来已有相关报道HSF1在癌症中可能发挥作用，近年来多项研究表明HSF1与卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌及乳腺癌等癌症相关〔5，10，11〕，激活HSF1的几个关键途径与恶性肿瘤有关，HSF1对癌症蛋白质组有系统性的影响〔12〕。张喆等〔10〕研究发现HSF1在卵巢高级别浆液性癌中促进侵袭转移。董丽涛〔11〕研究发现HSF1在子宫内膜癌中异常表达，与淋巴结转移有关。这与本研究的结果较为一致，说明在TNBC中具有重要的研究价值。Akt在细胞存活和凋亡中至关重要，对细胞代谢、细胞增殖、细胞周期等多种生物学行为进行调控；磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/Akt信号传导途径已经成为抗癌治疗中较重要的靶标，有研究表明PI3K/Akt与前列腺癌及乳腺癌等癌症相关〔4，13〕，PI3K/Akt途径通过其配体刺激受体酪氨酸激酶和其细胞质尾部的磷酸化而被激活。Henderson等〔13〕的研究发现PI3K/Akt在前列腺癌中促进细胞迁移，这与本研究的结果存在一定的相关性。有相关报道在乳腺癌中HSF1-Akt与上皮-间质转化(EMT)相关〔4〕。Denkert等〔4〕的研究发现HSF1-Akt联合促进乳腺癌细胞EMT。Carpenter等〔14〕研究发现HSF1-Akt联合促进乳腺癌的发展与转移，这与本研究的结果具有一致性。

本研究提示HSF1可能与肿瘤的发生发展及侵袭转移有关，HSF1的表达是构成性的，HSF1在细胞质内被Hsp90和其他抑制蛋白所控制，HSF1在S326上的核定位和磷酸化是HSF1活性的重要条件，因此核HSF1阳性与侵袭转移导致的预后不良相关。Akt可能与肿瘤的发生发展及恶性程度有关，PI3K/Akt信号通路对乳腺癌极其重要，大部分乳腺癌有PI3K-AKT活性增强与不良的临床结果相关，Akt介导的HSF1活化导致EMT，EMT是转移过程中的早期步骤〔14〕。HSF1与Akt的阳性表达都与肿瘤直径相关，这一结果为肿瘤的生长方式及转移形式提供了有力证据。HSF1-Akt在TNBC中呈正相关，具有协同作用，目前关于HSF1-Akt在TNBC中的表达与临床病理关系的研究尚少，本研究结果可以为进一步研究其机制提供有力的基础，然而由于本研究采集的病例数还有一定的局限性，接下来将开展细胞水平的研究。