衍生气相色谱法测定啤酒中甲醛含量方法的优化
2021-03-22李中贤赵灿方刘小培王俊伟余学军
李中贤, 宋 跃, 赵灿方, 刘小培, 王俊伟, 余学军
(1.河南省科学院高新技术研究中心,郑州 450002; 2.郑州铁路疾病预防控制所,郑州 450015)
甲醛俗称蚁醛,是无色、具有强烈气味的刺激性气体,易溶于水. 它是细胞原浆毒物,对人体细胞功能损害较大. 食品中甲醛进入人体后对肠道黏膜有刺激作用,可引起肺水肿,肝、肾充血及血管周围水肿,甚至可能致癌. 在我国,食品中禁止使用甲醛作添加剂,《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》(GB 2758—2012)也规定了甲醛在啤酒类样品中的最大残留限量为2.0 mg/L[1]. 但一些厂家为了增加啤酒的感观,在制作过程中仍加入少量甲醛,可能导致甲醛残留超标. 因此,对啤酒中甲醛含量的测定一直是啤酒行业乃至社会都关注的问题,尤为重要.
目前,啤酒中甲醛含量的测定方法主要有分光光度法[2-6]、液相色谱法[7-9]和气相色谱法[10-12]. 国家标准中采用紫外可见分光光度法测定啤酒中甲醛含量,其方法操作繁琐,易受干扰,准确度较差,灵敏度低. 液相色谱法[13-15]因甲醛极性太大,与溶剂峰同时流出,在紫外无吸收而无法检测. 直接气相色谱法[16-18]由于甲醛分子太小,直接进行分析时出峰太快,且在FID 检测器无响应. 衍生化-气相色谱法也有报道[19-20],而目前没有对衍生化的条件进行优化,分析检测时会产生误差. 因此,本研究以2,4-二硝基苯肼作衍生剂,在盐酸溶液中衍生啤酒样品中的甲醛,然后用直接超声法提取所生成的衍生物,通过正交试验设计对啤酒中甲醛含量测定的衍生化条件进行优化,建立气相色谱法准确测定啤酒中甲醛含量测定的最佳前处理方法,为相关部门对啤酒中甲醛含量的检测提供一定的参考依据.
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
岛津GC-2010Plus气相色谱仪,配电子捕获检测器(ECD)及GC solution工作站(日本岛津公司);Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore 公司);AS 3120A 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司). 甲醛标准溶液:2 mg/L(环境保护部标准样品研究所);正己烷:色谱纯;2,4-二硝基苯肼(DNPH):分析纯;盐酸:分析纯.
1.2 气相色谱条件
色谱柱:OV-17 石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.50 μm,中科院兰州化学物理研究所),柱温:220 ℃;进样口温度:220 ℃;电子捕获检测器温度:280 ℃;载气为高纯氮气(纯度>99.999%),流量:40 mL/min;氢气流量:40 mL/min;空气流量:400 mL/min;尾吹气流量:10 mL/min;分流比:30∶1;进样量:1.0 μL.
1.3 溶液的制备
DNPH溶液:称取100 mg DNPH溶解于24 mL浓盐酸中,加水定容至100 mL,置于棕色瓶中.
甲醛标准系列工作液:分别吸取甲醛标准溶液0、0.25、0.50、2.50、5.00、10.00 mL于10 mL容量瓶中,用水定容至刻度,依次配制成甲醛含量为0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mg/L系列标准溶液,现配现用.
1.4 标准曲线及样品的测定
分别取2.00 mL 甲醛标准系列工作液、啤酒试样于棕色具塞比色管中,各加入2.0 mL DNPH溶液(1 g/L),混匀后置65 ℃水浴中避光衍生30 min,然后在流水中快速冷却,加入2.0 mL正己烷,超声萃取10 min,取正己烷层待测.
将待测液注入气相色谱仪中,以保留时间定性,同时记录甲醛的色谱峰峰面积,由峰面积从标准曲线上求得试液中甲醛的含量.
2 结果与分析
2.1 衍生条件的优化
利用醛类物质在酸性介质中能与2,4-二硝基苯肼反应生成稳定的希夫碱[21]进行衍生化,反应式如下:
实验步骤:分别取2.00 mL 甲醛标准系列工作液于棕色具塞比色管中,各加入2.0 mL DNPH溶液(1 g/L),混匀后置于水浴中避光衍生一定时间,然后在流水中快速冷却,加入2.0 mL正己烷,超声萃取10 min,取正己烷层待测.
通过三因素三水平的正交实验,研究了衍生试剂用量、衍生温度和衍生时间对甲醛衍生物色谱峰分离效果的影响. 正交试验因素水平见表1,正交试验设计方案及统计分析结果见表2.
表1 正交试验因素水平表Tab.1 The orthogonal test factor level table
表2 正交试验设计方案及统计分析结果Tab.2 The design scheme and statistical analysis results of orthogonal test
实验结果显示,衍生温度对检测结果的影响比较大,其次是衍生时间和衍生剂用量. 甲醛衍生物随着衍生温度的提高呈递增趋势,但温度超过65 ℃后,增幅不大. 衍生溶液在65 ℃水浴中衍生10 min后,衍生物含量基本达到平衡. 在衍生温度、衍生时间固定的情况下,衍生产物随着衍生剂用量的增加而增多,但衍生剂用量过多会吸附于色谱柱上,使峰面积略有下降;用量过小将导致甲醛衍生不完全.
由表2 可知,第8 组甲醛衍生物色谱峰峰面积最大,最优条件组合为A3B2C1. 所以,实验采用该最佳组合,即衍生剂用量2.0 mL、衍生温度65 ℃和衍生时间30 min,对啤酒中的甲醛含量进行测定.
2.2 超声提取时间的选择
为进一步优化测试方法,在正交试验选择的最佳组合条件下,对超声提取时间进行了优化,结果图1.
由图1 可见,甲醛衍生物的色谱峰峰面积随着超声提取时间的增加而增大,超过10 min后衍生物含量基本趋于稳定,因此,实验确定超声提取时间为10 min.
图1 超声提取时间的影响Fig.1 Effect of the ultrasonic extraction time
2.3 色谱条件的优化
2.3.1 色谱柱的选择 在前人研究的基础上,保持其他色谱条件不变,分别使用极性、中等极性和弱极性的色谱柱对甲醛衍生物进行分析测定,结果表明,中等极性OV-17 柱的分离效果最好.甲醛标准溶液的气相色谱图见图2.
2.3.2 进样口、检测器及色谱柱温度的选择 在其他条件不变的情况下,分别改变进样口、检测器、色谱柱的温度,发现进样口、色谱柱温度对甲醛衍生物色谱峰分离效果影响不大,检测器温度对其分离效果影响显著. 通过优化,实验选择进样口温度220 ℃,电子捕获检测器温度280 ℃,色谱柱温度220 ℃.
2.4 方法的相关性
在优化的实验条件下,对甲醛标准系列衍生萃取液进行测定,每个浓度测定峰面积3 次,计算平均值,以甲醛标准系列工作液的浓度为横坐标,以甲醛衍生物色谱峰峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程y=59 668x+1 259.5,r=0.999 5. 由此可见,甲醛在0~2 mg/L的质量浓度范围内,具有良好的线性关系.
2.5 方法的回收率及精密度试验
在上述实验条件下,于不含甲醛的样品本底中,分别添加低、中、高三个浓度水平的标样,进行加标回收率试验;每个浓度平行做三份,每份重复测定6次,求均值,测定回收率及精密度. 结果显示,啤酒的平均加标回收率为87.3%~99.7%,相对标准偏差(RSD)为1.34%~2.24%. 结果见表3.
图2 甲醛衍生物色谱图Fig.2 Chromatogram of formaldehyde derivation
表3 方法回收率、精密度测定结果(n=6)Tab.3 The precision and accuracy of method(n=6)
2.6 实际样品的测定
在优化的实验条件下,对实际啤酒样品中的甲醛含量进行测定(图3). 结果显示,所有检测样品中甲醛含量均很低,大大低于我国《发酵酒及其配制酒卫生标准的分析方法》(GB/T 5009.49—2008)中规定的甲醛限量要求[2].
图3 某啤酒样品色谱图Fig.3 Chromatogram of wine sample
3 结论
本文以2,4-二硝基苯肼作衍生剂,通过正交实验选择了最佳的衍生剂用量、衍生温度和衍生时间,在盐酸溶液中对啤酒样品中的甲醛进行了衍生、超声提取,建立了气相色谱-电子捕获检测器(ECD)法测定啤酒中的甲醛含量. 该方法具有操作简单,分离度好,准确度高,重现性好等特点,满足相关检测规范要求,适用于啤酒中甲醛含量的检测.