衍生气相色谱法测定啤酒中甲醛含量方法的优化

李中贤， 宋 跃， 赵灿方， 刘小培， 王俊伟， 余学军

（1.河南省科学院高新技术研究中心，郑州 450002； 2.郑州铁路疾病预防控制所，郑州 450015）

甲醛俗称蚁醛，是无色、具有强烈气味的刺激性气体，易溶于水. 它是细胞原浆毒物，对人体细胞功能损害较大. 食品中甲醛进入人体后对肠道黏膜有刺激作用，可引起肺水肿，肝、肾充血及血管周围水肿，甚至可能致癌. 在我国，食品中禁止使用甲醛作添加剂，《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》（GB 2758—2012）也规定了甲醛在啤酒类样品中的最大残留限量为2.0 mg/L［1］. 但一些厂家为了增加啤酒的感观，在制作过程中仍加入少量甲醛，可能导致甲醛残留超标. 因此，对啤酒中甲醛含量的测定一直是啤酒行业乃至社会都关注的问题，尤为重要.

目前，啤酒中甲醛含量的测定方法主要有分光光度法［2-6］、液相色谱法［7-9］和气相色谱法［10-12］. 国家标准中采用紫外可见分光光度法测定啤酒中甲醛含量，其方法操作繁琐，易受干扰，准确度较差，灵敏度低. 液相色谱法［13-15］因甲醛极性太大，与溶剂峰同时流出，在紫外无吸收而无法检测. 直接气相色谱法［16-18］由于甲醛分子太小，直接进行分析时出峰太快，且在FID 检测器无响应. 衍生化-气相色谱法也有报道［19-20］，而目前没有对衍生化的条件进行优化，分析检测时会产生误差. 因此，本研究以2，4-二硝基苯肼作衍生剂，在盐酸溶液中衍生啤酒样品中的甲醛，然后用直接超声法提取所生成的衍生物，通过正交试验设计对啤酒中甲醛含量测定的衍生化条件进行优化，建立气相色谱法准确测定啤酒中甲醛含量测定的最佳前处理方法，为相关部门对啤酒中甲醛含量的检测提供一定的参考依据.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津GC-2010Plus气相色谱仪，配电子捕获检测器（ECD）及GC solution工作站（日本岛津公司）；Milli-Q高纯水发生器（美国Millipore 公司）；AS 3120A 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）. 甲醛标准溶液：2 mg/L（环境保护部标准样品研究所）；正己烷：色谱纯；2，4-二硝基苯肼（DNPH）：分析纯；盐酸：分析纯.

1.2 气相色谱条件

色谱柱：OV-17 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.50 μm，中科院兰州化学物理研究所），柱温：220 ℃；进样口温度：220 ℃；电子捕获检测器温度：280 ℃；载气为高纯氮气（纯度>99.999%），流量：40 mL/min；氢气流量：40 mL/min；空气流量：400 mL/min；尾吹气流量：10 mL/min；分流比：30∶1；进样量：1.0 μL.

1.3 溶液的制备

DNPH溶液：称取100 mg DNPH溶解于24 mL浓盐酸中，加水定容至100 mL，置于棕色瓶中.

甲醛标准系列工作液：分别吸取甲醛标准溶液0、0.25、0.50、2.50、5.00、10.00 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，依次配制成甲醛含量为0.00、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mg/L系列标准溶液，现配现用.

1.4 标准曲线及样品的测定

分别取2.00 mL 甲醛标准系列工作液、啤酒试样于棕色具塞比色管中，各加入2.0 mL DNPH溶液（1 g/L），混匀后置65 ℃水浴中避光衍生30 min，然后在流水中快速冷却，加入2.0 mL正己烷，超声萃取10 min，取正己烷层待测.

将待测液注入气相色谱仪中，以保留时间定性，同时记录甲醛的色谱峰峰面积，由峰面积从标准曲线上求得试液中甲醛的含量.

2 结果与分析

2.1 衍生条件的优化

利用醛类物质在酸性介质中能与2，4-二硝基苯肼反应生成稳定的希夫碱［21］进行衍生化，反应式如下：

实验步骤：分别取2.00 mL 甲醛标准系列工作液于棕色具塞比色管中，各加入2.0 mL DNPH溶液（1 g/L），混匀后置于水浴中避光衍生一定时间，然后在流水中快速冷却，加入2.0 mL正己烷，超声萃取10 min，取正己烷层待测.

通过三因素三水平的正交实验，研究了衍生试剂用量、衍生温度和衍生时间对甲醛衍生物色谱峰分离效果的影响. 正交试验因素水平见表1，正交试验设计方案及统计分析结果见表2.

表1 正交试验因素水平表Tab.1 The orthogonal test factor level table

表2 正交试验设计方案及统计分析结果Tab.2 The design scheme and statistical analysis results of orthogonal test

实验结果显示，衍生温度对检测结果的影响比较大，其次是衍生时间和衍生剂用量. 甲醛衍生物随着衍生温度的提高呈递增趋势，但温度超过65 ℃后，增幅不大. 衍生溶液在65 ℃水浴中衍生10 min后，衍生物含量基本达到平衡. 在衍生温度、衍生时间固定的情况下，衍生产物随着衍生剂用量的增加而增多，但衍生剂用量过多会吸附于色谱柱上，使峰面积略有下降；用量过小将导致甲醛衍生不完全.

由表2 可知，第8 组甲醛衍生物色谱峰峰面积最大，最优条件组合为A3B2C1. 所以，实验采用该最佳组合，即衍生剂用量2.0 mL、衍生温度65 ℃和衍生时间30 min，对啤酒中的甲醛含量进行测定.

2.2 超声提取时间的选择

为进一步优化测试方法，在正交试验选择的最佳组合条件下，对超声提取时间进行了优化，结果图1.

由图1 可见，甲醛衍生物的色谱峰峰面积随着超声提取时间的增加而增大，超过10 min后衍生物含量基本趋于稳定，因此，实验确定超声提取时间为10 min.

图1 超声提取时间的影响Fig.1 Effect of the ultrasonic extraction time

2.3 色谱条件的优化

2.3.1 色谱柱的选择 在前人研究的基础上，保持其他色谱条件不变，分别使用极性、中等极性和弱极性的色谱柱对甲醛衍生物进行分析测定，结果表明，中等极性OV-17 柱的分离效果最好.甲醛标准溶液的气相色谱图见图2.

2.3.2 进样口、检测器及色谱柱温度的选择 在其他条件不变的情况下，分别改变进样口、检测器、色谱柱的温度，发现进样口、色谱柱温度对甲醛衍生物色谱峰分离效果影响不大，检测器温度对其分离效果影响显著. 通过优化，实验选择进样口温度220 ℃，电子捕获检测器温度280 ℃，色谱柱温度220 ℃.

2.4 方法的相关性

在优化的实验条件下，对甲醛标准系列衍生萃取液进行测定，每个浓度测定峰面积3 次，计算平均值，以甲醛标准系列工作液的浓度为横坐标，以甲醛衍生物色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=59 668x+1 259.5，r=0.999 5. 由此可见，甲醛在0～2 mg/L的质量浓度范围内，具有良好的线性关系.

2.5 方法的回收率及精密度试验

在上述实验条件下，于不含甲醛的样品本底中，分别添加低、中、高三个浓度水平的标样，进行加标回收率试验；每个浓度平行做三份，每份重复测定6次，求均值，测定回收率及精密度. 结果显示，啤酒的平均加标回收率为87.3%～99.7%，相对标准偏差（RSD）为1.34%～2.24%. 结果见表3.

图2 甲醛衍生物色谱图Fig.2 Chromatogram of formaldehyde derivation

表3 方法回收率、精密度测定结果（n=6）Tab.3 The precision and accuracy of method（n=6）

2.6 实际样品的测定

在优化的实验条件下，对实际啤酒样品中的甲醛含量进行测定（图3）. 结果显示，所有检测样品中甲醛含量均很低，大大低于我国《发酵酒及其配制酒卫生标准的分析方法》（GB/T 5009.49—2008）中规定的甲醛限量要求［2］.

图3 某啤酒样品色谱图Fig.3 Chromatogram of wine sample

3 结论

本文以2，4-二硝基苯肼作衍生剂，通过正交实验选择了最佳的衍生剂用量、衍生温度和衍生时间，在盐酸溶液中对啤酒样品中的甲醛进行了衍生、超声提取，建立了气相色谱-电子捕获检测器（ECD）法测定啤酒中的甲醛含量. 该方法具有操作简单，分离度好，准确度高，重现性好等特点，满足相关检测规范要求，适用于啤酒中甲醛含量的检测.