耐冬山茶子叶再生体系的研究

田红梅 郭 霄 王奎玲 孙迎坤

（青岛农业大学园林与林学院，青岛 266109）

耐冬山茶［Camellia japonica（Naidong）］为山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）多年生常绿木本植物，主要分布于青岛崂山及附近岛屿，现有品种主要为野生资源的驯化衍生群体［1］。耐冬山茶花大娇艳，具有极高的观赏价值和园林应用价值，但其资源匮乏，生长缓慢［2］，传统的繁殖方法周期长且繁殖系数较低，不能满足市场的需求。而组织培养技术的日趋成熟为耐冬山茶加快品种繁育和品种创新提供了技术支撑。

在耐冬山茶组织培养方面，陈艳丽［3］以带腋芽茎段及嫩叶为外植体，研究了茎段丛生芽诱导分化和叶片愈伤组织诱导分化的条件。董慧慧［4］以耐冬山茶的茎段，新叶及叶柄为外植体对耐冬山茶愈伤组织的诱导进行了研究。杨凯［5］对耐冬山茶的胚状体和胚性愈伤组织的诱导进行了研究。吴斌［6～7］以耐冬山茶子叶为外植体，建立了耐冬山茶子叶愈伤组织途径再生体系。

本研究以耐冬山茶的子叶为外植体，通过对耐冬山茶种子消毒、子叶愈伤组织增殖及不定芽较优激素配比的筛选、不定根的诱导条件的研究，成功建立了以耐冬山茶子叶为外植体的植株再生体系，以期为耐冬山茶的扩繁及后期外源基因的转入提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

耐冬山茶的果实于2018 年9～10 月采自山东省青岛市植物园。

所用的植物基本培养基MS 固体培养基与1/2MS 固体培养基，其pH 均为5.8。均经116℃灭菌30 min 后备用。MW 液体培养基为M&W 维生素溶液添加2%的蔗糖。实验用椰汁为市场采购带壳椰子，取椰汁后将椰汁pH 调至7.8，加热后用滤纸过滤蛋白质［8］，经116℃灭菌30 min后备用。

外植体培养温度均为25℃，光照强度为5 500 lx，光照时间为12 h·d-1。

1.2 实验方法

1.2.1 耐冬山茶外植体的处理及愈伤组织的诱导

果实处理：将果实剥去果皮，将种子用自来水冲洗干净，放入灭好菌的培养瓶中，用75%的酒精浸泡10 s，然后用无菌水清洗2～3遍，沥干水分，盖上瓶盖，放入超净工作台。在无菌环境下，用75%的酒精浸泡30 s，然后用无菌水清洗2～3 次，接着用2%的NaClo 浸泡5、8、10、15 min，无菌水清洗5～6遍，清洗完毕后将种子铺在灭菌的滤纸上吸干表面的水分，备用。

用核桃钳剥去种子外皮，去除种子内皮和胚芽，将子叶切成0.3～0.5 cm3的小块接种于子叶诱导培养基MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-12，4-D［7］，每瓶接种3 块材料，每个处理组15 瓶，重复2 次，30 d后统计诱导率、污染率、干燥率。

1.2.2 耐冬山茶子叶愈伤组织的增殖

选取经过诱导后淡黄绿色，水润，长势良好的同一时期的子叶愈伤组织，切成0.3～0.5 cm3大小，接种前放到灭菌称量纸上于天秤上进行称重，称量完后接种于附加不同激素的MS 培养基上，每瓶接种3 块材料，每个处理组15 瓶，重复两次，每30 d 转接1 次，45 d 后称量愈伤组织的质量，记录其增殖倍数，同时观察记录愈伤组织的生长状态。

1.2.3 耐冬山茶子叶愈伤组织不定芽的分化

选取经过两次继代培养后，水润紧实、生长状态良好的愈伤组织，放置于不同激素配比的不定芽分化培养基中，每瓶接种4 块材料，每个处理组15瓶，每个处理组重复2次，每30 d转接1次。2个月后，统计耐冬山茶愈伤组织不定芽的分化率。

不定芽基本培养基为MS 固体培养基附加50 mg·L-1椰 汁，0.5 g·L-1脯 氨 酸 以 及0.1 g·L-1谷 氨酰胺。

1.2.4 耐冬山茶子叶愈伤组织不定芽的生根诱导

总的来说，该算法占用资源少、处理速度快，尤其适用于在图像目标的检测场合中实现硬件加速，因此该算法不仅适用于在线纸病检测系统，同时也适用于其他实时性较强的应用中，可以针对不同的应用场合灵活控制分块的数量，完成对图像目标的检测和提取，以提高系统的实时性。

将成型后约2 cm 高的不定芽切取单芽，单芽基部用500 mg·L-1的IBA 处理70 min，然后转接到不含任何激素的1/2MS 固体培养基和MW 液体培养基的滤纸桥上诱导生根。

每瓶接种1 株，每个处理组接种5 瓶，2 次重复。45 d后，统计不定芽的生根率。

1.3 统计指标

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对耐冬山茶愈伤组织诱导的影响

将耐冬山茶子叶接种到培养基约10 d，子叶开始变绿，部分子叶微微发红（见图1A），诱导15d左右出现愈伤组织，20 d 左右，愈伤组织呈现奶黄色，质地细密，基本覆满整个切口（见图1B），经过1个月的培养后，愈伤组织颗粒变大，呈浅黄绿色，颗粒状明显，愈伤组织基本能够覆盖整个子叶表面，且在子叶与培养基接触的部位愈伤组织生长量最大（见图1C）。

从图2可以看出，愈伤组织的染菌率随着消毒时间的延长整体呈下降趋势。当消毒时间为8min时，愈伤组织的染菌率较低为14.3%，且此时愈伤组织的干燥程度较低，干燥率仅为21.4%。当消毒时间低于8 min 时，染菌率上升，消毒时间高于8 min 时，愈伤组织的干燥率整体呈上升趋势。且愈伤组织的干燥率在消毒时间为15 min 时达到最高，可能是由于消毒时间过长对子叶产生了毒害作用。因此，长时间的消毒会对愈伤组织的生长状态产生影响。

虽然耐冬山茶种子在经过2 %的NaClo 消毒5，8，10 与15 min 后，其愈伤组织的诱导率均为100%，但为了后期愈伤组织的继代和不定芽的分化，我们将耐冬山茶种子的消毒时间定为8 min。

2.2 不同激素配比对耐冬山茶子叶愈伤组织增殖的影响

在不同激素配比的增殖培养基中，愈伤组织出现不同的生长状态。生长良好的愈伤组织为黄绿色，比较水润富有光泽（见图3A）。同时，在增殖过程中有部分愈伤组织出现不均质颗粒（见图3B），这与经过不定芽分化诱导的愈伤组织状态相似。

从表2分析得出，愈伤组织在继代培养过程中大致形成了以下几种类型：Ⅰ.浅黄色，水润，结构疏散；Ⅱ.黄绿色，微微发红，水润，质地紧实；Ⅲ.黄绿色，部分愈伤组织为浅红色，呈瘤状、不均质，质地紧实。在后期诱导分化过程中，Ⅰ型愈伤组织没有分化出不定芽，Ⅱ型愈伤组织呈现不均质的瘤状，质地紧实，分化出不定芽，Ⅲ型愈伤组织有不定芽的分化。

同时，从表2可以看出，在激素配比为0.4 mg·L-1NAA+1.5 mg·L-16-BA 与0.5 mg·L-1NAA+1.5 mg·L-16-BA中，愈伤组织增殖倍数较大，其增殖倍数分别为3.29与4.06，均属于Ⅲ型愈伤组织。

2.3 不同激素配比对耐冬山茶愈伤组织不定芽分化的影响

将愈伤组织接种至不定芽分化培养基20 d 左右，愈伤组织出现不均质颗粒，水润有光泽（见图4A）。45 d 左右，愈伤组织变得紧实，颗粒状更加明显，同时分化出绿色的不定小芽（见图4B），两个月左右，小芽逐渐成形并在愈伤组织上分化出多个不定芽（见图4C）。3 个月左右，不定芽芽条变得粗壮，长至约3 cm高（见图4D）。

表2 不同激素配比对耐冬山茶子叶愈伤组织增殖的影响Table 2 Effects of different hormone combinations on cotyledon callus growth

通过统计丛生芽的诱导率和生长状态（见表3）我们可以发现：生长素IBA 会导致愈伤组织呈现黑褐色，并不利于愈伤组织的分化；与IBA 相比，生长素NAA于更适于不定芽的诱导；而较高浓度的生长素更有利于不定芽的诱导。因此，适于愈伤组织不定芽分化的激素配比为1.0 mg·L-1NAA+10 mg·L-16-BA，丛生芽诱导率为10.7%。

2.4 耐冬山茶不定芽生根的诱导

通过实验发现，使用较高浓度的IBA 处理不定芽基部一段时间后，茎段会变红，膨大。与培养基接触的茎段部分会长出浅黄色的愈伤组织颗粒。半个月左右，膨大变大的茎段上长出有白色绒毛的半透明状的幼根（见图5A），1 个月左右幼根伸长，呈半透明状，微微发红，有白色绒毛（见图5B），2 个月左右，根逐渐粗壮，变成绿色（见图5C）。

从表4可以看出，使用较高浓度生长素对不定芽基部进行处理后再将不定芽放入MW 液体培养基进行培养，一段时间后，不定芽茎段变红、膨大，但并没有幼根的产生，或许是由于不定芽基部与空气接触不足。在无任何激素的1/2MS 固体培养基中，不定芽茎段不仅变红、膨大，而且在茎段部位还有少量愈伤组织的产生，根的诱导率为40%。

表3 不同激素配比对耐冬山茶愈伤组织不定芽分化的影响Table3 Effects of different hormone combinations on differentiation of C.japonica（Naidong）

表4 不同培养基种类对不定芽生根的影响Table 4 Effects of media types on differentiation of C.japonica（Naidong）

因此，1/2MS 固体更易于耐冬山茶不定芽的生根。

3 讨论

3.1 外植体的选择

选择合适的外植体对于植物组织培养是十分重要的。木本植物组织培养所用的外植体，一般是该植物的幼年组织，如子叶和嫩茎等［9］。从20世纪80年代开始，国内外以山茶的子叶，茎尖与带芽茎段等做为外植体成功获得山茶再生植株。

在预备实验中，使用耐冬山茶新叶及当年带腋芽的茎段为外植体进行愈伤组织诱导，实验结果发现叶片愈伤组织生长量小，生长缓慢，诱导愈伤组织过程中极易产生褐化，而茎段外植体的污染率和褐化率都较高。陈艳丽［3］在耐冬山茶叶片愈伤组织的不定芽诱导试验中，并没有获得不定芽。董慧慧［4］在研究外植体种类对耐冬山茶愈伤组织诱导的影响实验中发现，叶柄比茎段和叶片更容易产生愈伤组织，生长状态最好。在本次实验中，选用了耐冬山茶子叶作为外植体，经过愈伤组织、不定芽及不定根的诱导成功获得了耐冬山茶的再生植株。

因此，外植体的选择，不仅要考虑植物材料来源的丰富性、取材的难易程度以及后期材料保存的便利性，更重要的是考虑其分化能力的强弱。

3.2 耐冬山茶愈伤组织途径的植株再生

在光照条件下，经2%次NaClo 灭菌8 min，在激素配比为0.5 mg·L-12，4-D+0.5 mg·L-16-BA［7］的MS 培养基中耐冬山茶子叶愈伤组织的诱导率为100%，染菌率为14.3%。而吴斌［7］在相同的激素配比下，经0.1%的HgCl 混合液浸泡8 min 后的耐冬山茶子叶愈伤组织的诱导率分别为88.89%和100%，平均诱导率为94.45%。所得到诱导率低于本实验的诱导率，可能是因为选用了不同的消毒剂。

在继代培养过程中，通过细化愈伤组织的增殖激素配比，获得愈伤组织增殖的较优激素配比。同时，在子叶增殖实验中，形成了3 种类型的愈伤组织，其中Ⅱ型与Ⅲ型愈伤组织更有利于后期不定芽的分化。

本次实验中，通过研究不同激素配比对耐冬山茶子叶愈伤组织不定芽分化的影响，成功获得了耐冬山茶子叶愈伤组织的不定芽，不定芽的获得率为10.7%。愈伤组织不定芽诱导的成败与多种因素有关，其中最为重要的是植物生长调节剂的种类和浓度［10］。研究表明，在诱导分化时需要添加较低浓度的生长素和较高浓度的细胞分裂素，从而使外植体内源生长素含量逐渐降低，内源细胞分裂素逐渐升高，以促进植物愈伤组织的分化［11］。在后续的实验中，可以进一步细化NAA 和6-BA 的 浓 度，或 选 用 不 同 的 激 素 种 类KT［12～13］、TDZ［14～16］，或 不 同 的 培 养 基 种 类 如：WPM［10］、ER［17～18］、1/2ER［3］等。此外，也有研究表明，暗培养有利于不定芽的培养［19］，因此，后期也可以对外植体的培养条件进行改良优化，以提高不定芽的分化率。

木本植物在组织培养方面存在生根难等问题。而早在1997年，应承纪等［20］通过采用“浸没—纸桥生根法”成功解决了云南山茶生根困难的问题，其生根率达80%以上。本次实验参考“浸没—纸桥生根法”，将不定芽芽条经高浓度生长素（500 mg·L-1的IBA）处理70 min 后在1/2MS 固体培养基中成功获得不定根，根的诱导率为40%。而吴斌［7］在预备试验中，直接使用含较低浓度NAA 或IBA的1/2MS 固体培养基诱导不定芽并未获得生根苗。此次不定根的诱导试验并未对生长素的浸没时间以及培养条件进行深入的研究，在后期的试验中，可以延长、细化生长素的浸没时间或降低光照强度［21］以提高愈伤组织不定根的诱导率，从而建立更高效的再生体系。