水稻抗虫(Cry1C)和抗稻瘟病(Pi1, Pi2)材料的创制

柳絮，张华，宣宁，李平波，张梦琦，姚方印

(山东省农业科学院生物技术研究中心，山东 济南 250100)

水稻(OryzasativaL.)是重要的粮食作物，为全球近一半人口的主食，因此水稻的稳产、高产对保障世界粮食安全具有重要意义。病虫害是危害粮食安全的主要因素之一，水稻生产周期的某一个阶段如果受到病虫害的侵袭，其产量和品质将会受到极大的影响。

稻瘟病是水稻的主要病害，由病原菌Magnaportheoryzae引起。研究表明，全球每年由于稻瘟病造成的水稻减产量可以满足6 000万人口的粮食需求，导致的直接经济损失高达50亿美元[1，2]。稻瘟病在水稻秧苗期至抽穗期均可发生。苗期或分蘖期发病严重时，可导致植株死亡；穗期发病会导致白穗或半饱和穗，产量大幅度降低，严重时可造成水稻绝收。稻瘟病病原菌的生理小种多样，并且变异复杂。因此，应用单一的抗性水稻品种难以解决水稻持久抗稻瘟病的问题。近年来，随着分子生物学的发展，越来越多的稻瘟病抗性基因被定位。本试验选用的供体亲本空育131带有广谱稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2。

鳞翅目害虫一直是水稻上最大的威胁之一，由于水稻本身尚未发现有效的抗虫基因，传统育种面临很多困难。目前，Bt毒蛋白基因是使用最广泛的抗虫基因，用转基因的方法将Bt蛋白基因导入常规水稻，可提高水稻对螟虫的抗性[3，4]。利用水稻抗稻瘟病基因优质资源，培育具有持久抗性的水稻品种，同样是防治稻瘟病最经济有效且对环境最安全的方法[1，5]。本实验室利用以籼稻明恢63为遗传背景的抗虫转基因株系T1C-19与黄淮稻区圣稻15进行杂交和多代回交，已经育成了带有抗虫基因Cry1C，且农艺性状优良的转基因抗虫水稻新品系济抗10号[6]。

目前，黄淮稻区生产上应用的大部分水稻品种抗病虫能力不强，易遭受病虫为害，导致产量和品质不稳定[7，8]。为防治病虫害而大量使用农药则存在高成本、高毒性、高残留等问题，易造成环境污染，为食品安全带来隐患。因此，对水稻品种的抗病虫性进行改良，聚合不同的抗性基因，通过培育抗性品种防治病虫害更加经济、高效与环保。本试验利用济抗10号为受体亲本，选择带有广谱高抗稻瘟病基因(Pi1，Pi2)的空育131为供体，进行杂交与多代回交，通过分子标记辅助选择，结合田间农艺性状筛选，育成了抗虫和高抗稻瘟病以及适合黄淮稻区种植的4个优良水稻新品系，为黄淮稻区抗病虫水稻育种奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 亲本材料

济抗10号为本实验室利用以籼稻明恢63为遗传背景的抗虫转基因株系T1C-19与黄淮稻区圣稻15进行杂交和多代回交选育而成，带有抗虫基因Cry1C；带有广谱高抗稻瘟病基因(Pi1，Pi2)的空育131由黑龙江大学李荣田教授提供。利用济抗10号为受体亲本，空育131为稻瘟病抗性基因的供体亲本进行杂交与回交。

1.2 杂交与回交转育过程

于8月中下旬选取正处于开花期的水稻，以济抗10号为母本，46℃温水去雄，以空育131为父本进行杂交获得F1代，再以济抗10号为轮回亲本，连续回交获得BC1F1、BC2F1、BC3F1等世代以及自交后代BC3F2。在开花前对每一个杂交或回交后代单株均进行Basta(有效成分PPT)抗性选择，PPT浓度为1 g/L[9]，PCR跟踪稻瘟病抗性基因，并结合田间农艺性状，从中选择抗虫且高抗稻瘟病植株再与轮回亲本连续回交，或自交纯和。

1.3 田间Basta抗性选择

待水稻植株长至20 cm左右时，用棉签浸蘸除草剂Basta后涂抹在叶片正反面，3～5 d后统计抗性植株及敏感株数。涂抹处叶片颜色无变化的为抗性植株，叶片颜色变黄的为敏感植株。

1.4 抗稻瘟病基因功能标记检测

选取Basta检测阳性的植株，摘取幼嫩叶片，充分研磨，利用TPS法[10]提取DNA，备用。所筛选的与稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2紧密连锁的多态性分子标记分别为RM224和P131[11，12]，PCR反应总体积为20 μL，反应体系为：94℃ 5 min； 94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环[13]；72℃ 5 min。PCR产物经6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染，保鲜膜包胶保存并记录结果。

1.5 稻瘟病自然诱发抗性鉴定

自然诱发病圃设在济南饮马泉实验农场，病圃全生育期不喷洒杀菌剂，共进行2次病情调查，分别为移栽前的苗叶瘟调查和黄熟期的穗颈瘟调查。苗叶瘟调查时在每个株系的发病中心选择有代表性的病丛，以发病最重的20～50张叶片平均发病等级作为该株系的抗性级别；穗颈瘟调查时每小区至少100穗。田间的栽培管理、调查方法、病级划分、记载标准和抗性评价按照颜群等[14]的水稻品种试验抗性鉴定方法与标准执行。稻瘟病综合指数=苗叶瘟病级×25%+穗颈瘟发病率病级×25%+穗颈瘟损失率病级×50%。

1.6 田间抗虫鉴定

在不用任何药剂防治的情况下，于每年稻纵卷叶螟高发期田间调查其危害情况及其引起的白穗发生情况，并统计白穗率。

1.7 双抗材料的田间种植及农艺性状考察

在济南饮马泉试验农场种植高抗稻瘟病的转基因抗虫水稻材料，小区面积为66.7 m2，重复2次，同时种植济抗10号为对照。田间管理同大田，但不施用任何防病虫农药。考察的农艺性状有抽穗期、株高、穗长、穗粒数、千粒重和产量等。

2 结果与分析

2.1 转育经过

2016年配置杂交组合济抗10号(Cry1C)×空育131(Pi1，Pi2)；2017年以济抗10号为轮回亲本进行回交，获得BC1F1和BC2F1；2018年获得BC3F1；2019年自交获得BC3F2。

2.2 Basta抗性鉴定

2017年共检测杂交后代单株158株，其中Basta抗性植株107株，敏感植株51株，然后选取Basta抗性植株进行稻瘟病抗性分子标记辅助选择。选出的15个材料与轮回亲本济抗10号回交获得的BC1F1代种子同年在海南南繁实验基地进行加代选育获得BC2F1，收获的材料于2018年在济南实验基地种植后继续进行Basta抗性鉴定，2018年共检测回交后代单株255株，其中Basta抗性单株236株，选取抗性单株继续进行稻瘟病抗性分子标记辅助选择并进行田间农艺性状筛选。2018年选出的16个材料分别与轮回亲本济抗10号继续回交获得BC3F1，在水稻成熟期，通过农艺性状筛选和田间的稻瘟病抗性鉴定，筛选出了4个材料SK01、SK02、SK03、SK04，在2019年自交纯和获得BC3F2。

2.3 分离世代单株稻瘟病抗性基因功能标记检测

对每一世代单株均分别进行稻瘟病抗性基因(Pi1，Pi2)的功能标记检测，选取与空育131(Pi1，Pi2)基因型相同的阳性单株继续与轮回亲本济抗10号进行回交，部分功能标记检测结果如图1、图2所示。

P1: 空育131(Pi1); P2: 济抗10号; 1～48: BC2F1代单株; 2, 3, 4, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 42: 带有Pi1基因的纯和单株; 5, 7, 9, 11, 13, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44: 带有Pi1基因的杂合单株。

P1: 空育131(Pi2); P2: 济抗10号; 1～20: BC2F1代单株; 1, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 17, 18, 20: 带有Pi2基因的杂合单株。

2.4 田间稻瘟病抗性鉴定

经过杂交和回交转育， 2019年6—9月对已自交纯和的4个材料SK01、SK02、SK03、SK04进行苗叶瘟抗性鉴定和黄熟期穗颈瘟抗性鉴定。与轮回亲本济抗10号相比，改良株系SK02的稻瘟病抗性明显提高，稻瘟病综合指数为3.5；轮回亲本济抗10号的稻瘟病综合指数为6.9级，抗性评价为感病。4个改良株系稻瘟病综合指数均在4.0以下，为抗病，其中抗性最好的是SK02(表1)。

2.5 亲本与双抗株系的田间抗虫性鉴定

2019年6—10月对已自交纯和的4个材料SK01、SK02、SK03、SK04进行田间抗虫性鉴定。在稻纵卷叶螟大发生时期，济抗10号和已自交纯和的4个双抗株系几乎没有受到卷叶螟的危害，空育131的卷叶螟危害较为严重，白穗率为39.79%，而选育的4个双抗株系的白穗率相当低，均小于0.20%(表2)。

表1 稻瘟病抗性鉴定结果

表2 亲本与双抗株系稻纵卷叶螟危害情况

2.6 田间农艺性状评价

回交转育的目的是为了将抗虫基因与抗稻瘟病基因聚合，创制出抗虫(Cry1C)和抗稻瘟病(Pi1，Pi2)的水稻新材料，所以在对抗性进行选育的同时，更注重了对产量、品质等综合性状的选育。由表3可知，SK01、SK02、SK03、SK04不仅表现出很好的抗虫、抗稻瘟病特性，而且表现出明显

表3 亲本及双抗株系主要农艺性状

的丰产性状；米质与已育成的适宜于黄淮稻区种植的轮回亲本济抗10号相当。

3 讨论与结论

目前，有不少水稻抗病和抗虫基因已被定位和克隆，且有一部分基因被广泛应用于抗性育种中[15，16]，抗病虫的水稻品种培育也取得了一定进展。通过分子标记辅助选择技术进行基因聚合，将不同的抗病虫基因进行组合将会为新育成的水稻品种提供更加稳定和持久的抗性[17,18]。利用分子标记辅助选择技术聚合水稻抗性基因已有很多先例，一些水稻新品系已成功选育，且部分品种(组合)已通过审定。倪大虎等[19]利用分子标记辅助育种将Xa23和Pi9基因聚合在一起，聚合系既抗白叶枯病又抗稻瘟病，抗性和抗谱均与亲本相当。Liu等[20]利用分子标记辅助选择技术将2个褐飞虱基因Bph3和Bph27(t)导入易感品种Ningjing3中，得到的聚合系很大程度上提高了对褐飞虱的抗性，避免了由于褐飞虱影响而造成的产量损失。

虽然本实验室已成功选育出了适合于黄淮稻区种植的抗虫品种，但是稻瘟病仍是黄淮稻区的主要病害，每年都对水稻的产量和品质造成严重影响。在众多的防治措施中，最为经济、安全、环保和有效的控制稻瘟病方法是通过发掘、鉴定和利用广谱持久抗性基因，培育并推广抗病新品种，提高栽培品种的稻瘟病抗性水平，延长品种的抗病周期。因此，本研究将分子标记辅助选择技术与传统育种方法相结合，采用杂交、回交等方法将稻瘟病抗性基因转入到本实验室已育成的适宜于黄淮稻区种植的转基因新品系济抗10号(Cry1C)中，育成了抗虫和高抗稻瘟病的优良水稻新品系4个，为充分利用稻瘟病抗性基因和抗虫基因进行聚合获得双抗的水稻材料提供了广阔的前景。