山东省肉鸡养殖场大肠杆菌的分离鉴定及抗药性监测

赵效南，张印，胡明，张庆，李璐璐，骆延波，许晓辉，刘玉庆

(山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南 250100)

大肠杆菌是一种常见的人畜共患病病原菌，可导致禽的败血症、气囊炎、输卵管炎、蜂窝组织炎、心周炎、腹膜炎和卵黄囊感染等，给养禽业造成巨大的经济损失[1]。动物粪便被认为是大肠杆菌的主要来源。

抗生素主要用于治疗或者预防动物疾病，其中一些抗生素被作为饲料添加剂用于促进动物生长[2-4]。由于抗生素不合理的使用，导致耐药菌株和多重耐药菌株的出现[5]。据报道，在巴西，商品肉鸡多重耐药大肠杆菌的分离率为71.0%[6]；在意大利，从鸡肉中分离出的大肠杆菌66.9%属于多重耐药菌[7]；在埃及，禽源大肠杆菌分离株100%属于多重耐药菌[8]。耐药性大肠杆菌可能会通过食物链传递给人类，造成人类感染治疗的失败，从而对公共安全造成危害[9]。

山东是我国肉鸡养殖大省，商品肉鸡年出栏量在16.5亿只。由于抗生素的不合理使用，导致动物源耐药菌大量产生和快速传播。因此对肉鸡养殖场大肠杆菌的抗药性进行持续监测是非常必要的。本研究于2018—2019年从山东省3个规模化养鸡场中采集新鲜粪便样品，对其进行大肠杆菌的分离鉴定和抗药性分析，旨在了解山东地区养鸡场耐药特点，为养殖场抗生素的合理使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018—2019年从山东省3个规模化肉鸡养殖场采集123份新鲜粪便样品，每个养鸡场规模均超过15万只。样品采集后，置于无菌采样袋中，并放置于冰盒中，立即带回实验室进行细菌学分析。

1.2 大肠杆菌的分离与鉴定

取约2 g新鲜粪便至5 mL胰蛋白酶大豆肉汤培养基中，37℃孵育24 h，然后取100 μL涂布于麦康凯琼脂平板上，37℃培养18～24 h，挑取粉红色、边缘光滑湿润的扁圆菌落进行纯化，对纯化后的可疑单菌落进行革兰氏染色和生化试验。利用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌DNA，通过PCR扩增16S rRNA基因，上游引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物为1429R：5′-GGTTACCTTGTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系(25 μL)：H2O 18.375 μL，Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶 0.125 μL。反应程序：94℃ 10 min；94℃ 30 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 5 min。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果与GenBank 数据库进行比对。阳性菌株使用胰蛋白酶大豆肉汤甘油(20%)在-20℃下保存。

1.3 药敏试验

采用美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐的微量肉汤稀释法对大肠杆菌分离株进行11种常用抗生素的敏感性试验，包括氟苯尼考、庆大霉素、阿莫西林-克拉维酸、头孢噻呋、多粘菌素、新霉素、恩诺沙星、美罗培南、多西环素、氨苄西林和安普霉素。以大肠埃希氏菌ATCC25922作为质控菌株。药物敏感试验结果通过2018年CLSI标准[10]和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(http://www.eucast.org/ Clinical.breakpoints)进行评估。如对3类或3类以上抗生素耐受，则判定为多重耐药菌。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2016软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌的分离和鉴定结果

大肠杆菌分离株革兰氏染色镜检结果为革兰氏阴性菌，两端钝圆，短小呈杆状。生化试验特征：V-P试验为阴性、吲哚试验为阳性、产酸不产气、不分解尿素，发酵甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖等。通过16S rRNA 基因测序比对，最终从3个规模化肉鸡养殖场123份新鲜粪便样品中共分离到123株大肠杆菌。

2.2 药敏试验结果

药敏试验结果(图1)显示，123株大肠杆菌分离株对11种抗生素的耐药率在0～100%。所有分离株对多西环素耐药、对美罗培南敏感；大多数大肠杆菌分离株耐药率超过50%。由表1可知，对9种抗生素耐药的菌株多达34株，对8种抗生素耐药的菌株有28株，对10种抗生素耐药的菌株有26株，对7种抗生素耐药的菌株有24株，对6种抗生素耐药的菌株有5株，对5种抗生素耐药的菌株有3株，对4种抗生素耐药的有2株。其多重耐药率为99.2%。

图1 药敏试验结果

表1 大肠杆菌耐药谱

3 讨论与结论

大肠杆菌是人和动物肠道内的常见菌，且广泛存在于自然界中，在一定条件下可引起动物的败血症、肠炎等疾病，对畜牧养殖业造成巨大的经济损失[11]。为了解山东地区养鸡场大肠杆菌的耐药特点，本试验于2018—2019年通过采集3个规模化养鸡场的新鲜粪便样品，分离并鉴定出123株大肠杆菌，并对大肠杆菌的抗药性进行监测。

由于抗生素在养殖业的滥用，导致高抗或多抗大肠杆菌不断被检出。大肠杆菌的耐药性已经对公共卫生安全造成严重威胁。本研究药敏试验结果显示，大肠杆菌分离株对多西环素的耐药率高达100%，与Jahantigh等[2]报道的从感染大肠杆菌的鸡场中分离的大肠杆菌对多西环素耐药率高达96%一致[2]。多西环素的副作用小，且价格低廉，是治疗和控制各种家禽疾病最常用的抗生素[12，13]。大肠杆菌对多西环素的高耐药率与养殖场中过度使用该类抗生素有关。本研究中大肠杆菌分离株对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、氟苯尼考、头孢噻呋、多粘菌素、新霉素、庆大霉素和恩诺沙星的耐药率达到50%以上。王志浩等[14]报道的山东省鸡源大肠杆菌对氨苄西林和氟苯尼考的耐药率在67%以上，对头孢菌素类抗生素耐药率高达38.4%～44.9%，对氟喹诺酮类抗生素耐药率在26.8%～50.0%。Adesiyun等[15]研究表明，大肠杆菌分离株对四环素类抗生素的耐药率在58.5%，对氟喹诺酮类抗生素耐药率在9.3%～25.4%。Jahantigh等[16]试验结果表明，从鸡中分离的大肠杆菌对氟喹诺酮类抗生素耐药率在17%～100%，对头孢菌素类抗生素耐药率在50%，对四环素类抗生素耐药率在95%。本研究结果与以上报道一致，表明养鸡场中大肠杆菌的耐药性非常严重。本试验中所有大肠杆菌分离株对美罗培南敏感，这可能与养殖场中很少使用这种抗生素有关。

多重耐药大肠杆菌的出现对公共卫生构成威胁。本研究表明养鸡场中99.2%大肠杆菌呈多重耐药性且耐药谱大多在7种以上，与报道的禽源大肠杆菌分离株多重耐药率为100%结果一致[8]，但远远高于吴少鹏等[17]报道的山东省某地区奶牛源大肠杆菌的多重耐药率(22.2%)。这可能与地域、物种、养殖场用药不同有关。

肉鸡是人类蛋白质的主要来源，但其容易感染大肠杆菌，因此养鸡场应做好管理，避免继发细菌感染。为降低大肠杆菌的抗药性，应防止包括肉鸡在内的食用动物中抗生素的滥用。