茶皂素对豫南地区猪源细菌抑菌效果的研究

刘 涛，王 瑞

(信阳农林学院，河南 信阳 464000)

0 引言

茶皂素属于皂素类，是由茶叶籽提取出来较复杂的糖式化合物，同时也是一种良好的表面活性剂。茶皂素的应用开发非常广泛，在日用化工、医药、养殖上均有应用。研究将茶皂素配制成不同浓度试剂，研究其对豫南地区分离到的猪源大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌及沙门氏菌的抑菌效果，为开发茶皂素抑菌试剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验菌种由信阳农林学院预防兽医实验室保存；茶皂素(60%)购自山东优索化工科技有限公司；营养琼脂培养基、LB营养肉汤培养基、麦康凯琼脂培养基、葡萄球菌选择性琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂购自青岛海博生物有限公司。

1.2 仪器设备

超净工作台(SW-CJ-2F， 苏州净化有限公司)、恒温生化培养箱(250B，常州市华普达教学仪器有限公司)。

1.3 茶皂素抑菌效果测定

1.3.1 菌种的活化

将实验室保存的大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌菌种接种到相应的培养基上，放置于37℃恒温培养箱培养18～24 h。

1.3.2 细菌形态学观察

将活化好的大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌进行革兰氏染色，镜检。

1.3.3 药敏片制备

取双圈定性滤纸用打孔器打成6 mm直径的纸片备用。每10片放置于洁净青霉素瓶中，然后用干净纱布封口，经121℃高压20 min灭菌，再放入37℃恒温生化培养箱烘干直至干燥。称取0.5 g、0.6 g、0.7 g、0.8 g、0.9 g、1 g、1.5 g茶皂素，分别加1 mL灭菌蒸馏水进行溶解，将溶解后的茶皂素溶液缓慢倒入装有药敏片的瓶中。

1.3.4 菌悬液制备与含菌培养基制备

菌悬液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌用灭菌接种环挑取单个菌落，分别选取3支试管对细菌进行倍比稀释。

含菌培养基的制备：把高压灭菌好的普通营养琼脂培养基倒入培养皿中，放置在超净台冷却。然后把稀释倍数为10-3的菌液用移液枪抽取30 μL倾注培养基中，并用灭菌涂菌棒将菌液涂布均匀，放置于37℃恒温培养箱培养18～24 h后观察结果，备用。

1.3.5 药敏试验

将不同浓度(0.5～0.9 g/mL)的含茶皂素药敏片，用灭菌镊子取出，呈十字形贴布，浓度为1 g/mL、1.5 g/mL的含茶皂素药敏片呈一字形贴布，每种细菌对应2个营养琼脂培养基，放入37℃恒温培养箱，培养18～24 h后观察结果。

2 结果与分析

2.1 复苏菌种革兰氏染色镜检结果

复苏菌种革兰氏染色镜检结果，如图1所示。

2.2 药敏试验结果

从抑菌圈直径测定结果可知，60%茶皂素对大肠杆菌和葡萄球菌具有抑菌效果，而沙门氏菌、链球菌具有较强的耐药性，药敏结果，如图2、表1所示。

图1 复苏菌种革兰氏染色镜检结果

图2 药敏试验结果

表1 60%茶皂素对细菌敏感性

3 讨论

通过本次茶皂素药敏试验结果可知，60%茶皂素配制成1 g/mL、1.5 g/mL浓度时，对大肠杆菌有明显抑菌效果，但配制各浓度的茶皂素制剂，对葡萄球菌、沙门氏菌和链球菌均无抑菌效果。而2013年游瑞云[1]等茶皂素的抑菌性能研究，结果显示，大肠杆菌和葡萄球菌在57%的茶皂素中浓度为10 mg/mL，大肠杆菌抑菌圈直径为10 mm，对葡萄球菌无抑菌效果，而在98%茶皂素中(浓度为10 mg/mL)葡萄球菌出现最低抑菌效果(10 mm)。而2014年马戎[2]茶籽饼茶皂素提取及抑菌效果的研究，结果显示，茶皂素对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用，但对金黄色葡萄球菌抑制作用较小。而2019年郭海阳[3]等茶皂素的美白功效及其抑菌和抗氧化活性研究，结果显示，茶皂素溶液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均表现出较明显的抑制作用，对黑曲霉的抑菌效果较弱，对沙门氏菌无抑制作用。

通过本试验结果和前期相关研究结论表明，茶皂素对豫南地区猪场分离到的部分常见病原菌，抑菌效果表现均不相同，抑制效果对浓度表现出较明显依赖性，对大肠杆菌的抑菌效果最为明显，而其他菌种的抑菌效果较弱。李金洪[4]推测茶皂素表面活性作用改变了细胞膜的通透性，进而萜类物质破坏细胞内构造和酶系统，同时，茶皂素水解后产生的有机酸使细胞内液酸化，破坏各细胞器的正常功能与代谢。相对于革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌细胞壁具有较厚而致密的肽聚糖层，这个可能也是茶皂素在革兰氏阴性菌的抑菌性上优于革兰氏阳性菌的原因之一。

根据国家统计局数据：截至2019年我国油茶籽产量285万t，油茶籽中含有12%～18%的茶皂素，因此每年可生产34.2万～ 51.3万t茶皂素。目前茶皂素主要用于轻工、化工、农药、饲料、养殖、纺织、采油、采矿、建材与高速公路建设等方面。2020年7月1起，饲料生产企业禁止在饲料中添加药物性饲料添加剂，中国正式进入饲料禁抗时代，寻找可部分替代抗生素的产品是大势所趋。欧洲是世界上最早提出饲料无抗的地区。通过总结他们在无抗饲料方面的经验发现，禁抗后第一年料肉比升高、治疗用药量增加，尤其是关节炎和腹泻治疗用药增加明显，这一现象大约会持续1年。茶皂素本身是一种优良的天然表面活性剂，如果能够将茶皂素开发成绿色抑菌制剂，用于产房环境消毒和母猪产前体表护理剂，大大减少目前各种化学消毒剂的使用，有利于环境生态安全，同时可提高油茶加工企业产品附加值。