棘胸蛙歪头病病原菌分离及单克隆抗体制备

李秋晴，田 苇，赵正亿，郑荣泉，3，4通信作者

(1.浙江师范大学，浙江 金华 321004；2.贵州黔东南桥水农业科技开发有限责任公司，贵州 黔东南 556000；3.浙江省野生动物生物技术与保护利用重点实验室，浙江 金华 321004；4.浙江师范大学行知学院，浙江 金华 321100)

1 概述

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，在分类上属于两栖纲(Amphibia)、无尾目(Anura)、叉舌蛙科(Dicroglossidae)、棘胸蛙属(Quasipaa)[1]，是我国特有的两栖类动物，俗称石蛙、棘蛙。在棘胸蛙人工养殖中，大部分养殖户为了追求经济效益而进行密度养殖，同时存在养殖设备老旧，养殖水体循环不畅等问题，导致棘胸蛙患病率大大增加。国内已相继报道了棘胸蛙的腹水病、脑膜炎、红腿病、肠胃炎、出血病、肝肿大病及爱德华氏菌病等蛙类疾病。歪头病(脑膜炎)是目前蛙类中危害较大的疾病之一，该病主要症状是蛙头部歪斜，泳动时身体打转，失去平衡力，同时还有白内障等并发症，致死率高，传播迅速。不同研究者从具有该类症状的病蛙中分离出至少9种具致病力的细菌，其中脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)最多见[2]。如张奇亚等[3]在患有“旋游症”的美国青蛙的脑组织分离到了脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)，即脑膜炎败血伊丽莎白金菌。叶雪平[4]报道的由该菌引起的牛蛙发病，具有歪头、肤色发黑的现象。李明[5]、宋婷婷[6]也报道了由该菌引起的棘胸蛙歪头病，此外，他们还发现除口服方式外，皮肤损伤或不损伤浸泡及肌肉注射都能导致棘胸蛙发病。同时研究还发现脑膜炎败血伊丽莎白金菌具有强耐药性[7]。在实际的养殖过程中也发现该病菌一旦感染，抗生素防治效果不佳的情况。

目前为止，棘胸蛙歪头病感染的脑膜炎败血伊丽莎白金菌的单克隆抗体和免疫组织化学技术方面的研究尚属空白，对脑膜炎败血伊丽莎白金菌开展相关技术研究，在棘胸蛙歪头病诊断防治中具有较好的应用价值和理论价值。

2 材料和方法

2.1 试验动物及细菌

患病的棘胸蛙样本采集于浙江省某棘胸蛙养殖场，Balc/b小白鼠购于金华实验动物中心，Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞购于Sigma公司，试验用嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、迟缓爱德华氏菌由浙江省特种水产研究实验室提供。

2.2 实验方法

2.2.1 病蛙细菌分离、纯化及鉴定

对病蛙进行解剖，观察病蛙是否具有内脏病变。在无菌条件下，取病蛙的脑、眼睛、肝脏、肾脏等组织，取样划线分离于普通营养琼脂固体培养基，得到单菌落。观察菌落的大小、颜色、干湿、形态等菌落特征，并接种于斜面培养基，保存于4℃备用。

对细菌采用梅里埃微生物自动鉴定系统，按照说明书对所分离得到的细菌进行生理生化实验，对细菌进行鉴定。

2.2.2 棘胸蛙脑膜炎致病菌单克隆抗体制备

取灭活的脑膜炎败血伊丽莎白金菌注射Balc/b小鼠，共注射4次，每次间隔1周，以浓度为1×109CFU/mL的菌悬液与弗氏完全佐剂1∶1混合为注射液，每次剂量为0.1 mL，最后一次免疫后第3天取脾脏用于细胞融合[8]。

取良好的骨髓瘤细胞以及小鼠脾细胞，按比例为5：1进行混合匀化细胞，缓慢加入HAT培养基重悬，轻轻混匀，并加入预先准备好的细胞培养板中。每10 mL移液管中加入1孔(每孔8 mL)，并将80～100 μL(含10 mL/平板)加入配好的细胞培养板中，在37℃的CO2培养箱中孵育并观察。

在细胞融合后的第1天，观察细胞，记录细胞的生长状态。培养3～5 d换细胞培养液HAT，10 d为HT，20 d改为1640完全培养基[9]。

2.2.3 筛选分泌抗体的杂交瘤细胞及抗体特异性检测

取未灭活的致病菌，使用无菌水制成1×109CFU/mL的菌悬液，用包被液稀释10倍后取100 μL加入96孔酶标版各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。每孔加200 μL或加满封闭液，37℃ 2 h后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。

选取上实验中阳性杂交瘤细胞株培养上清液50～100 μL/孔加样到包被好的酶标板中，采用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测抗原活性，将迟缓爱德华氏菌，嗜水气单胞菌，每孔加200μL或加满封闭液，包被于96孔酶标板中，读取各孔OD值，与阴性及阳性数据进行计算对照。

3 结果与分析

3.1 病原菌的分离与鉴定

本实验于无菌操作下取患有歪头病的棘胸蛙各组织进行划线分离，其中从脑组织分离培养获得了大量菌落，推测该部分细菌的感染造成棘胸蛙歪头症状；从脑组织(推测造成脑损伤)、肝脏中分离得到了少许菌落。分离所得菌落大小、形态 、颜色、干湿度均相似，在37℃下长势良好。分离得到的菌落中，细菌菌落表现为黄的小菌落，直径约为2 mm，其边缘完整，没有凸起，表面潮湿。

从这些菌落中选取2株接种至普通营养琼脂培养基进行纯培养，将其命名为：菌株SP01，于4℃下保存。该致病菌经过梅里埃微生物自动鉴定系统鉴定为脑膜炎败血伊丽莎白金菌。

3.2 单克隆抗体的制备

取菌液浓度为1.0×108CFU/mL的灭活脑膜炎败血伊丽莎白菌菌液免疫小鼠后，于35 d后取眼血用间接ELISA测量血清效价，结果呈阳性，可用于加强免疫后进行细胞融合。

融合后3 d，残余SP2/0骨髓瘤细胞在HAT液中全部死亡，融合后5 d可见杂交瘤细胞呈集落性生长，2周后可见培养孔内杂交瘤细胞生长至底孔面积约1/3，上清液开始变黄，脑膜炎伊丽莎白菌的融合率约为55%。

3.3 杂交瘤细胞的筛选抗原特异性检测结果

用间接ELISA反应，筛选出3株能分泌脑膜炎伊丽莎白菌抗体的细胞株，命名为1A4，1A6和1F5，对着者株细胞株进行交叉反应筛选，发现1A4与1F5与迟缓爱德华氏菌存在交叉反应，1A6可分泌脑膜炎伊丽莎白菌的单克隆抗体，与其他常见水产养殖致病菌不存在交叉反应，特异性强，可用于进一步实验。具体数据，如表1所示。

表1 单克隆抗体ELISA特异性检测结果

4 讨论与总结

本实验对患有歪头病的棘胸蛙各组织进行划线分离，分离所得细菌菌落形态均相似，对脑组织分离到的优势细菌进行鉴定，鉴定结果均为伊丽莎白菌属细菌中的脑膜炎败血伊丽莎白菌(E.meningoseptica)。由于未利用此菌株对棘胸蛙进行回归感染，因而无法判定其是否为棘胸蛙歪头病的病原菌，但可以明确的是，脑膜炎败血伊丽莎白菌为此次采集的歪头病棘胸蛙体内的优势菌种，可以透过血脑屏障，感染棘胸蛙脑组织，并影响棘胸蛙其他器官。同时此次试验所得与张奇亚[4]、雷雪平[10]、何成伟[11]等的实验相符，脑膜炎败血伊丽莎白菌为水生动物养殖中歪头病的常见致病菌。

单克隆抗体在水产养殖疾病防范方面起到重大作用，可以对疾病进行诊断[12]、免疫[13]及药物残留检测[14]，通过分子免疫学的手段制备单克隆抗体，可以减少水产养殖过程中的消耗，为水生动物疾病的预防、检测、治疗提供新的手段。本次研究制备了棘胸蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌的单克隆抗体，单克隆抗体制备技术具有高度持续性，实验包括了众多的细胞培养和筛选，生物化学检测分析等实验，而抗体的特异性是抗体应用价值的关键。本次研究主要就是为了筛选出特异性高活性的脑膜炎败血伊丽莎白金菌单克隆抗体。

本次实验从患歪头病棘胸蛙上分离得菌株SP01，结合梅里埃微生物自动鉴定系统，证明该细菌为脑膜炎败血伊丽莎白金菌。为了对该病原菌进行快速准确的早期诊断，本次实验制备了抗棘胸蛙脑膜炎败血伊丽莎白金菌单克隆抗体，用间接ELISA法进行检测，结果显示实验获得杂交瘤细胞株1A6具有较好的抗体活性，与其他常见致病菌无交叉反应，特异性良好，能够为后期制作免疫胶体金及免疫组织化学观察等提供前期基础性研究，有利于为棘胸蛙人工养殖业提供技术支撑，具有较好的经济、社会与生态效益。