蛋白质组学技术在妇科疾病研究中的应用

2021-03-19黄原昕赖东梅

上海交通大学学报（医学版） 2021年2期

黄原昕，赖东梅

上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院上海市胚胎源性疾病重点实验室，上海200030

蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质的组成及其变化规律，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、亚细胞定位或迁移、蛋白与蛋白相互作用等［1］，由此获得蛋白质水平上关于疾病发生、细胞代谢等过程的认识。蛋白质组学通过比较正常人与患者生物样本之间蛋白质种类、表达量、修饰状态的差异，可由此筛选出与疾病诊断治疗相关的蛋白质标志物或潜在治疗靶点，阐明疾病发生发展的分子机制或发展新的治疗技术。蛋白质组学技术在妇科疾病中的研究应用逐步展开，本文对此进行综述。

1 蛋白质组学技术

1.1 定量蛋白质组学

蛋白质组学研究目前广泛应用的是“自下而上”的策略。传统的鸟枪法策略最初基于蛋白质分离技术——双向凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE），而液相色谱（liquid chromatography，LC）的引入让蛋白质定量分析变得更为准确。其基本流程为蛋白质样本经过蛋白酶消化后由LC 分离，再进行质谱分析和数据库检索。由此开发出脱离凝胶的定量方法，包括同位素标签定量法和非标记定量法。同位素标签定量法中，肽与各种同位素标签相连，其中离子信号对应样本中的相对肽丰度。最常见的同位素标签法包括：细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）、同位素编码亲和标签（isotope-coded affinity tag，ICAT）、相对和绝对定量的同位素标签（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）和串联质谱标签法（tandem mass tags，TMT）。与之相对，非标记定量法基于前体信号强度或光谱计数，样本制备更简便，可检测范围更大，技术进步得益于高分辨率质谱仪的发展［2］。

1.2 数据采集方式

经典的鸟枪法属于数据依赖采集模式（datadependent acquisition，DDA），可以一次性分析大量蛋白质，但可重复性较低。靶向质谱技术，主要基于选择/多重/平行反应监测技术（selected-/multiple-/parallel reaction monitoring，SRM/MRM/PRM），可以提供目标蛋白精确的绝对定量结果，是质谱绝对定量的金标准，但有低通量的缺点。数据非依赖采集模式（data independent analysis，DIA），融合了上述两者的特点，已成为生物标志物发现的常规方法［3］。DIA 代表性的技术为全碎片离子顺序窗口化获取质谱（sequential window acquisition of all theoretical mass spectra，SWATH），能将质谱扫描范围分为若干窗口，高速、循环地分析每个窗口中的离子。

1.3 翻译后修饰

蛋白质组分析的另一项挑战是翻译后修饰，如糖基化、泛素化、磷酸化、甲基化等。利用蛋白质发生修饰后的质量偏移可以实现翻译后修饰位点的鉴定；同时，由于翻译后修饰的蛋白质在样本中含量低且动态范围广，质谱检测前通常需要对发生修饰的蛋白质或肽段进行富集［4］。

1.4 蛋白质和肽组织成像

血浆是复杂的生物样本，所含蛋白质的丰度差异极大，使得生物标志物的发现变得复杂。人体组织样本蛋白质的种类虽然少，却富含与疾病相关的特定分子，因此直接分析组织样本，尤其是对于肿瘤的研究，是一种很有前景的方法。基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱成像技术（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight imaging mass spectrometry， MALDI-TOF-IMS）不仅能直接分析肿瘤组织中的蛋白质组，更能提供有关脂质和代谢物等相关物质的空间分布信息［5］。

2 蛋白质组学在妇科疾病研究中的应用

2.1 多囊卵巢综合征

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱的症候群［6］。PCOS病理生理机制尚不明确，可能涉及的机制有下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamus-pituitary-ovarian axis，HPA axis）功能异常、胰岛素抵抗和高胰岛素血症以及肾上腺内分泌异常。近年来，蛋白质组学的发展为研究PCOS发病内在机制提供了进一步探索的方向，其中一些代表性研究发现的生物标志物见表1。

2.1.1 卵泡卵泡液构成卵母细胞发育的微环境，卵巢病理过程常常涉及卵泡液的变化。Ambekar 等［7］的研究中，对接受辅助生殖技术的健康女性和PCOS患者的卵泡液取样后用液相色谱-质谱法（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）进行分析，鉴定出186 种表达上调或下调的蛋白质，这些蛋白表达水平变化引起了酶活性、氧化应激、基底膜成分、血卵屏障、卵泡血管生成、卵丘复合体的异常，在一定程度上解释了PCOS患者卵泡发育停滞或异常的原因。Patil 等［8］的研究则利用3种凝集素对卵泡液中的糖蛋白富集后进行对比分析，发现10 种差异表达蛋白，经过验证，α1-抗胰蛋白酶（alpha-1-antitrypsin，SERPINA1）上调和α-胰蛋白酶抑制剂重链4 （inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4，ITIH4）下调，这些蛋白质在血管生成和维持细胞外基质稳定方面发挥作用，对卵泡成熟至关重要。

卵巢颗粒细胞是卵泡发育过程中的重要参与者。Lan等［9］研究比较了PCOS患者与正常对照组的卵巢颗粒细胞基因表达谱的差异，其中差异表达的基因涉及氨基酸代谢、细胞增殖、生殖系统发育等过程，并发现参与构成促分裂原活化的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogenactivated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）信号通路的促分裂原活化的蛋白激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase 4，MAPKK4）和磷酸细胞外信号调节激酶1/2（phospho-ERK1/2）可能是影响PCOS 患者卵巢颗粒细胞功能的关键蛋白。关于PCOS 患者不易受孕的原因，除了卵巢功能异常之外，Amjadi 等［10］的研究发现其可能还与PCOS 患者子宫内膜组织中凋亡、氧化应激、炎症相关蛋白表达异常有关。

2.1.2 血浆血液样本的检测虽然干扰因素较多，但能对全身疾病状态有宏观了解。分析患有胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和无胰岛素抵抗（NIR）的PCOS患者血清样本，可以发现IR 组血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TAG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、尿酸（uric acid，UA）水平高于NIR 组，发现4 种蛋白表达升高——α-白蛋白（alpha albumin/Afamin， AFM）、血清转铁蛋白（serotransferrin）、补体C3 和载脂蛋白C3（apolipoprotein C3，APOC3）。其中APOC3 的升高经过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）证实［11］。另外，Fazilat 等［12］发现在排卵型PCOS 患者（ovulatory PCOS，OPCOS）的血清中促分裂原活化的蛋白激酶4 （mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）表达下降，可能增高了患高脂血症、高雄激素血症和代谢综合征的风险。Arffman 等［13］比较了是否患有PCOS的晚期妊娠孕妇的血浆，预测PCOS与妊娠期不良事件发生风险的关系，发现35 种差异表达的蛋白质，涉及免疫应答、心血管疾病发生和细胞增殖等过程，其中P 因子（properdin）和胰岛素样生长因子Ⅱ（insulin-like growth factor-Ⅱ，IGF-Ⅱ）增高幅度最大。

表1 PCOS相关生物标志物Tab 1 Biomarkers of PCOS

3 早发性卵巢功能不全

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI），是指在40 岁之前出现超过4 个月以上闭经，并且连续2 次间隔4 周以上的血清促性腺激素（follicle stimulating hormone，FSH）水平>25 IU/L。卵巢功能早衰可导致女性不孕，并提前出现衰老，且长时间的低雌激素水平将增加女性罹患骨质疏松、冠状动脉粥样硬化性心脏病、认知功能障碍等疾病的风险。90%以上的POI 为特发性，无明确病因，可能与遗传因素、免疫因素、酶或受体缺陷、物理化学因素等有关［14］，主要包括3 种发生机制，即卵母细胞池减少、卵泡发育障碍、卵泡闭锁加速。

3.1 卵泡

最近，超重被认为是卵母细胞发育停滞的影响因素。对正常体质量和超重女性的卵泡液进行基于iTRAQ 技术的蛋白质组学分析，发现22 种蛋白表达上调和21 种蛋白表达下调，经ELISA 验证人附睾蛋白4 （human epididymis protein 4，HE4/WFDC2）可能提示超重女性卵母细胞异常发育的情况［15］。Xu 等［16］发现始基卵泡形成与内质网钙结合蛋白1 （reticulocalbin-1/-3，RCN1/RCN3）、核内不均一核糖核蛋白K （heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K， HNRNPK）、肌动蛋白（actin）等有关，而向初级卵泡过渡与穹窿体主蛋白（major vault protein，MVP）等有关。

3.2 血浆

目前，蛋白质组学技术应用于POI 诊断及治疗的研究并不多。Lee 等［17］利用LC-MS/MS 鉴定了POI 患者血清中差异表达的11 种蛋白质，其中5 种与生殖系统相关，包括血浆铜蓝蛋白（ceruloplasmin）、补体 C3（complement C3）、纤维素原α 和β（fibrinogen α/β）、性激素结合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG），均是潜在的蛋白质生物标志物，见表2。

研究影响卵泡发育的因素，引起卵泡凋亡加速的机制，对早期发现POI、延缓卵巢功能衰退、预防POI远期并发症，都具有重要的临床价值。

4 上皮性卵巢癌

上皮性卵巢癌是常见的女性生殖器官恶性肿瘤之一，发病率次于宫颈癌（cervical cancer，CC）和子宫内膜癌（endometrial cancer，EC），病死率却位于生殖器官恶性肿瘤之首。上皮性卵巢癌患者的预后差，目前仍缺乏有效的治疗手段。将蛋白质组学技术应用于卵巢癌发病机制、生物学特性的研究，并寻找高灵敏度和高特异度的生物标志物，有望帮助早期诊断、早期治疗和个性化治疗，从而改善患者预后。

对卵巢肿瘤蛋白质组进行全面检测，并结合基因组数据进行分析，可以发现其中的关联。基因片段拷贝数的变化将同时引起蛋白质组的变化；反之蛋白质参与的信号通路也影响基因的表达，尤其是与短期整体生存最相关的信号通路集合，可用来预测疾病的临床转归［18］。

表2 POI相关生物标志物Tab 2 Biomarkers of POI

4.1 血浆

血浆所含蛋白质的丰度差异极大，蛋白质生物标志物的发现比较复杂，近年来SRM/MRM为代表的靶向质谱技术能较好地克服定量检测中遇到的障碍。Hüttenhain等［19］提出基于SRM 的用于寻找血浆中蛋白质生物标志物的策略，先通过比较蛋白质组学方法筛选出候选标志物，再通过SRM对样本中的候选标志物进行定量检测，其中5种联合糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）检测能提高卵巢癌的诊断率。不同类型上皮性卵巢癌的蛋白质组有所差异，这些差异蛋白可辅助进行分型。Dieters-Castator等［20］应用非标记定量蛋白质组学技术，发现8种蛋白质，组合后能鉴别子宫内膜样卵巢癌和高级别浆液性卵巢癌，将鉴别诊断准确率提高至99.2%。

4.2 肿瘤组织与肿瘤细胞

4.2.1 肿瘤转移肿瘤的发生发展和转移需要肿瘤细胞和肿瘤基质的相互作用。Curtis 等［21］使用SILAC 以及无标签定量磷酸化蛋白质组学技术研究肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）之间的双向信号通路，发现肿瘤细胞中糖原动员依赖于后者中的p38α MAPK 活化，通过减少p38α 及抑制糖原磷酸化酶1（phosphoglucomutase 1， PGM1）能减少肿瘤转移。Eckert 等［22］改进了一套非标记定量的蛋白质组学研究流程，并对卵巢癌细胞及肿瘤基质进行分析，发现肿瘤蛋白质组从原位癌到转移的过程是稳定的，而肿瘤基质内烟酰胺-N-甲基转移酶（nicotinamide N-methyltransferase，NNMT）以及其调节的几个蛋白质的表达量异常，NNMT的增加使组蛋白甲基化减少，促进CAF表达肿瘤增殖、转移相关蛋白。许多研究已表明肿瘤的发生发展伴随糖基化的异常。Everest-Dass 等［23］在福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）切片上特定的组织区域使用N-酶苷酶F 预处理，再用多孔石墨化碳液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（porous graphitized carbon liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，PGLC-ESI-MS/MS）和MALDI-MSI 可以分别得到经过N-糖基化加工的蛋白质的丰度和空间分布信息，结果表明肿瘤细胞表面和分泌蛋白中含有复杂的多聚甘露糖结构，同时许多患者血清中也发现了抗多聚甘露糖结构的抗体。

4.2.2 耐药性上皮性卵巢癌对化学治疗（化疗）比较敏感，多采用铂类为基础的联合化疗方法，但大多数高级别浆液性卵巢癌患者对铂类会产生抗药性并出现复发，仅约15%的患者能保持10 年以上不出现复发转移。Coscia 等［24］采用质谱定量分析了对铂敏感及对铂耐药患者的肿瘤组织蛋白质，并通过对蛋白质磷酸化和相互作用的研究，发现肿瘤-睾丸抗原45（cancer/testis antigen 45，CT45）能调节磷酸化酶4的活性，增加DNA损伤和对铂的敏感性，CT45 衍生的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）肽段还能使肿瘤细胞被T 细胞识别并杀灭。Zhang 等［25］发现含硫氧还原蛋白结构域蛋白 17 （thioredoxin domain-containing protein 17，TXNDC17）的高表达与紫杉醇耐药性有关，可以增加卵巢癌细胞自噬体形成从而使紫杉醇的杀伤力降低。上述肿瘤组织中发现的生物标志物见表3。

表3 卵巢癌相关生物标志物Tab 3 Biomarkers of ovarian cancer

5 EC

全世界每年约7.6 万女性因EC 而死亡，病死率及新增病例的不断增加使其成为影响女性健康的重要疾病。子宫体肿瘤绝大部分是EC，起源于子宫内膜腺上皮。EC的发生发展过程主要为：正常或萎缩的子宫内膜腺上皮在雌激素作用下过度增生，随着异性细胞不断积累而出现不典型增生，最后发展为低级别或高级别EC。后期如发生上皮-间质细胞转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），会进一步发生转移。早期EC 的存活率较高，因此早期诊断和早期治疗可以极大改善EC 患者的预后。

5.1 血浆

近年来，针对外周血中循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA （circulating tumor DNA，ctDNA）、蛋白质及细胞外泌体等肿瘤相关标志物的研究较多。因样本容易获得，外周血中的生物标志物检测在EC 早期诊断中被寄予厚望。目前发现的潜在血清蛋白质标志物包括：①内分泌激素：催乳素（prolactin，PRL）、促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，FSH）。②补体：补体C3、补体C4A。③癌相关抗原：CA125。④血浆脂蛋白：载脂蛋白A（apolipoprotein A，ApoA）。 ⑤酶类：基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMP）。 ⑥酶抑制剂： HE4、SERPINA1等。需要注意其中有些蛋白，如脂蛋白，可能与EC 风险因素之一的肥胖相关，但用于诊断还需进一步验证［26］。HE4 和CA125 已经多次被验证在EC 患者血清中含量增加，其中HE4 对EC 检测的灵敏度为31.5%～78.8%，特异度为65.5%～100%，两者组合并不显著提高HE4 的灵敏度［27］。在未来研究中，采取多种预测潜力较大的蛋白组合建立诊断模型，能进一步提高癌症高风险人群中筛查效率及准确性。一项以前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌筛查试验为基础设计的巢式病例对照研究，从纳入筛查试验的人群中筛选出112 例患EC 的绝经后女性作为病例组并匹配出112例对照组，通过定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析诊断前的血清样本，初步筛选出病例组及对照组有差异的蛋白质，通过回归分析找到6种有潜在高预测能力的蛋白质，并根据抽血与确诊EC的时间来综合评价其预测能力［28］。

5.2 尿液

尿液标本以其非侵入性、价格低廉、易获取的优点，很适合作为检测样本。尿液中含量异常的蛋白质，如钙黏着蛋白-1 （cadherin-1， CDH1）、玻连蛋白（vitronectin， VTN）和硫酸乙酰肝素蛋白多糖2（heparan sulphate proteoglycan 2，HSPG2）有希望成为潜在的生物标志物［29］。Mu 等［30］通过表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术（surface-enhanced laser desorption ionization time of flight，SELDI-TOF）检测到质荷比为1 201和1 449的肽段，其鉴别EC、卵巢癌、CC的灵敏度和特异度均为100%。但尿液中的蛋白质浓度变化大，依赖肾脏代谢，且存在易被阴道分泌物污染等因素，作为生物标志物仍有局限性。

5.3 内膜组织

90%的EC 患者有异常子宫出血（abnormal uterine bleeding，AUB）的症状，有AUB症状的患者仅5%～10%患有EC，这表明大量患有良性疾病的女性需要排除EC。目前较常规的方法是阴道超声和诊断性刮宫术。宫腔吸片通过塑料管吸取宫腔内的脱落细胞来筛查EC，与诊断性刮宫术相比，患者痛苦小且易于接受，但取材不够全面，活检结果与最终子宫切除标本病理结果差异较大。Martinez-Garcia 等［31］通过对宫腔吸片中的液体进行蛋白质组研究，在患者中找到连环素β1 （catenin beta 1，CTNB1）等3种蛋白质的表达增高，并证明这3种蛋白组合可以提高宫腔吸片对EC 组织类型和等级的诊断，以及术前评估的准确性。

子宫内膜组织样本的蛋白质组检测能有助于研究EC的发生发展过程并找到潜在的治疗靶点。一项研究［32］对正常子宫内膜、复杂性子宫内膜增生、非典型性子宫内膜增生以及EC 的组织进行蛋白质组学分析，发现碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CAH1）和肽基脯氨酰异构酶B（peptidylprolyl isomerase B，PPIB）在疾病进展中的含量递增，说明这些蛋白可能与子宫内膜病变进展有关。通过多反应监测技术，发现在高复发风险EC 患者中，循环中细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）与微环境作用形成转移灶的过程中，可溶性半乳糖凝素3 结合蛋白（lectin galactoside-binding soluble 3 binding protein，LGALS3BP）含量明显增高。

随着质谱技术的发展，有临床应用潜力的EC 生物标志物逐渐被发现，EC的生物标志物如表4所示。

6 CC

CC 是妇科最常见的恶性肿瘤，由宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）进展而来。大多数CC 与人乳头瘤病毒HPV （human papilloma virus，HPV）感染有关，其中70%由HPV16 和HPV18 引起。CIN 分为3 级，反映CIN 发生发展的连续病理过程。在细胞学筛查分类中，CINⅠ对应低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL），高级别鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）包括CINⅡ、CINⅢ和原位癌。

表4 EC相关生物标志物Tab 4 Biomarkers of EC

20 世纪50 年代以来，子宫颈细胞学筛查和HPV DNA检测的普遍应用，使CC和CIN患者得到早期发现和治疗，CC 的发病率及病死率有了明显下降；并且随着HPV 疫苗的逐步推广，CC 可望成为一种可以预防的肿瘤。但是，CIN 发病率的降低，会导致LSIL、HSIL 及恶性病变细胞学筛查的敏感度、特异度、阳性预测值下降，未来可能不适合早期CC 的筛查［33］。在发展中国家和地区，宫颈细胞学筛查存在普及率低、费用高、病理诊断主观因素大等问题。

6.1 宫颈阴道液

宫颈阴道液（cervical vaginal fluid，CVF）与癌组织或癌前组织直接接触，许多重要的CC 生物标志物浓度在CVF 中会很高，且CVF 不接触其他组织，是较为理想的样本来源。通过棉签、刷子等工具自行采集CVF，再进行后续的DNA 基因分型、免疫组化等检测，能更方便女性参与CC 筛查。Arbyn 等［34］进行的meta 分析验证了基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的HPV 自检测的可行性。但由于HPV 检测需要专业技术和设备，因此推广受限。在对健康女性和高危型、低危型HPV 感染者的CVF 样本检测中，其中α-辅肌动蛋白4（actinin alpha 4，ACTN4）是最有希望的CC 癌前状态的潜在标志物。ACTN4 被发现在多种肿瘤中过度表达，主要起到促进细胞迁移的作用，还参与信号转导、染色质重构和转录。有研究以基于LC-MS/MS 的非标记定量法对CC 不同阶段患者的蛋白质组进行检测，来反映CIN 的疾病进展程度，并建立相应的统计模型，分别将HSIL 患者和CC 患者，正常对照及LSIL 患者进行鉴别诊断，灵敏度为77%～100%，特异度为94%～100%［35］。

6.2 血浆

有研究［36］将CC 发生过程中各个病变阶段的血浆蛋白质组进行比较寻找表达差异的蛋白质。同时对健康对照、LSIL、HSIL、CC 患者治疗前后的血浆样本进行分析，包含类黏蛋白2（orosomucoid 2，ORM2）在内的5种蛋白质标志物在LSIL 和HSIL 组表现出明显的差异表达，可作为CC 进展的潜在生物标志物。与治疗前相比，治疗后患者的补体因子I（complement factor I，CFI）蛋白水平明显下降，表明其对疗效具有预测价值。所有这些不同表达的蛋白质都与补体系统和凝血级联系统相关。另一项研究［37］通过比较健康对照、LSIL、HSIL、CC 患者血液中丝氨酸残基的磷酸化修饰特征，发现磷酸化修饰蛋白随着疾病进展而呈现递增趋势，提示异常磷酸化可能参与CC的病变过程。CC生物标志物见表5。