盐度胁迫对大鳞鲃抗氧化酶和血清皮质醇的影响*

张宇婷 杨 建 耿龙武 王 雨 姜海峰 徐 伟①

(1. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心 上海 201306；2. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所哈尔滨 150070；3. 上海海洋大学 农业农村部淡水水产种植资源重点实验室 上海 201306)

盐度是影响鱼类机体生理生化状态的重要环境因子之一，对鱼类的生存(严银龙等, 2019)、生长发育(El-Leithy et al, 2019)影响显著。研究表明，广盐性鱼类在转入高盐度水体过程中，机体为维持内环境稳态，会消耗大量的能量，同时产生大量的有害代谢产物，如超氧负离子自由基、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)等(胡静等, 2015)，而机体内的非特异性免疫酶类，如酸性磷酸酶(Acidic phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)等则在保护机体免受过氧化物二次损伤过程中发挥着重要作用；而皮质醇则在能量代谢和免疫调控方面发挥着重要作用。当鱼类长期处于胁迫环境时，会导致其机体代谢紊乱、免疫机能下降，甚至引起鱼类的死亡(Li et al, 2017;Hoseini et al, 2019; 齐明, 2014)。

大鳞鲃为鲤科(Cyprinidae)、鲃亚科(Barbinae)、鲃属(Barbus)鱼类(Nikoriski, 1958)。目前，关于大鳞鲃的盐度适应性研究主要集中在生存(杨建等, 2014)、生长发育(党云飞等, 2013)、渗透调控(耿龙武等, 2011)等方面。在免疫机能的影响方面，仅初步检测了超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)在肝、肾和鳃组织中的时空变化(杨建,2014)。为全面揭示盐度胁迫对大鳞鲃机体免疫应激水平的影响，以便为大鳞鲃盐碱水域的养殖提供更加准确、有效的参考，本研究检测分析不同盐度胁迫下，大鳞鲃肝、肾和鳃组织中ACP、AKP、GSH-Px 和MDA 等氧化应激参数和血清皮质醇水平的变化，以期阐明盐度胁迫对大鳞鲃抗氧化能力和机体应激水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验鱼取自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所呼兰试验站。随机选300 尾体长为(25.0±0.5) cm、体重为(95.00±5.56) g 的健康、体型正常的个体于室内暂养3 d，暂养用水为曝气2 d 的自来水，水温为(24.0±1.5)℃。

根据杨建等(2014)的结果和盐度预实验结果，本实验设置4 个NaCl 盐度实验组(3、6、9 和12 g/L)和1 个淡水对照组，每个梯度设置3 个平行组。实验溶液采用曝气2 d 的自来水和NaCl(国产，分析纯)在体积为200 L 的玻璃缸中进行配制，并用盐度测量仪(上海三信仪表厂，SX713-02 型)检测校准。溶液配制完成后稳定2 d。各实验组随机挑选20 尾大鳞鲃进行为期7 d 的耐受实验，实验期间水温为(24.0±1.5)℃。

1.2 实验方法与样品采集

各组分别于实验开始后3、6、12、24、48、96 h和7 d 进行样品采集，用40 mg/L 的MS-222 在实验相同盐度梯度下麻醉，每个盐度实验组在每个时间点于3 个平行组随机采集1 尾实验鱼，共采集3 尾。尾部静脉采集血液样本，4℃条件下3000 r/min 离心10 min，取上清液，–80℃保存待测；冰上解剖实验鱼，采集其肝、肾和鳃组织，并用4℃预冷的生理盐水润洗，用吸水纸吸干后迅速放入冻存管，液氮保存待测。

1.3 组织氧化应激指标和血清皮质醇测定

取0.2 g 肝、肾和鳃组织样本，按照质量与体积比1∶9 加入预冷的0.86%生理盐水，用组织研磨仪(MM400, Retsch) 10000～15000 r/min 研磨成10%组织匀浆。将制备好的10%匀浆4℃条件下2500 r/min 离心10 min，取上清液，用于测定ACP、AKP、MDA和GSH-PX 等氧化应激指标，测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

采用酶联免疫法ELISA 和Synergy HTX 多功能检测仪(Bio Tek)测定大鳞鲃血清皮质醇，试剂盒购自上海酶联生物有限公司(Cat.# m1003467-C)。

1.4 数据分析

实验结果采用SPSS 20.0 与Graphpad prism5 进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，实验结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示。同一时间点的不同盐度组进行Duncan´s 多重比较，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 盐度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃ACP 活力的影响

由图1 可知，在胁迫初期，相同盐度胁迫时间，3 种组织中ACP 的活力均随着盐度的升高而升高；而在相同盐度条件下，大鳞鲃的肝、肾和鳃中的ACP活力随着时间的延长均呈先上升后下降并趋于平稳的变化趋势。肝、肾和鳃中ACP 活力分别在胁迫12、6 和24 h 达到峰值，之后逐步下降并趋于稳定；而淡水对照组3 种组织中ACP 活力的变化范围分别为1.27～1.42、1.46～1.62 和0.98～1.17 U/g prot，在整个实验过程中酶活力变化不大。此外，肾中ACP 活力显著高于肝和鳃，其在肝、肾和鳃组织中的活力范围分别为1.27～1.96、1.42～2.15 和0.98～1.96 U/g prot。

2.2 盐度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃AKP 活力的影响

图1 盐度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织的ACP 活力的影响Fig.1 Effects of salinity stress on ACP activity in liver,kidney and gill of L. capito

由图2 可知，在盐度胁迫初期，在相同胁迫时间下，肝、肾和鳃组织中AKP 活力随着盐度的升高显著升高(P＜0.05)；而在同一盐度胁迫下，大鳞鲃3 种组织中的AKP 活力随着时间的延长亦呈先上升后下降并趋于平稳的变化趋势。肝和肾组织中AKP 活力在12 h 时最大，而鳃组织则在24 h 出现峰值；肝和肾组织自24 h 开始下降并趋于平稳，而鳃组织在48 h时下降后趋于平稳。淡水对照组3 种组织中AKP 的活力范围分别为0.32～0.37、1.03～1.23 和0.98～1.17金氏单位/g prot，在整个实验过程中AKP 活力变化不显著(P＞0.05)。AKP 活力在肾组织中显著高于其他2种组织，其在肝、肾和鳃组织中的变化范围分别为0.31～0.86、1.01～1.87 和0.13～0.84 金氏单位/g prot。

2.3 盐度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃GSH-Px 活力的影响

图2 盐度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织的AKP 活力影响Fig.2 Effects of salinity stress on AKP activity in liver,kidney and gill of L. capito

由图3 可知，初期相同胁迫时间下，肝、肾、鳃组织的GSH-Px 活力随盐度的升高而升高；随着胁迫时间的延长，大鳞鲃3 种组织中的GSH-Px 活力在相同盐度胁迫下呈先上升后下降并趋于平稳的变化趋势。肝和肾组织中GSH-Px 的活力在胁迫24 h 达到峰值，鳃组织则在胁迫6 h 达到顶峰；肾和鳃组织均在96 h 时趋于平稳，肝组织则在7 d 时趋于稳定；淡水对照组3 种组织中GSH-Px 活力的变化范围分别为44.41～46.68、17.19～21.59 和9.07～13.18 活力单位，在整个实验过程中变化差异不大。此外，肝组织的GSH-Px 活力显著高于肾和鳃组织，GSH-Px 在肝、肾和鳃组织中的活力范围分别为 44.41～114.77、16.25～67.59 和9.07～48.00 活力单位。

图3 盐度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织GSH-Px 活力的影响Fig.3 Effects of salinity stress on GSH-Px activity in liver,kidney and gill of L. capito

2.4 盐度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织中MDA 含量的影响

由图4 可知，胁迫初期相同时间点，大鳞鲃肝、肾和鳃的 MDA 含量亦随盐度的升高而显著升高(P＜0.05)；大鳞鲃的肝、肾和鳃中的MDA 含量在相同盐度条件下，随着胁迫时间的延长均呈先上升后下降，并趋于平稳的变化趋势。其中，3 种组织中MDA含量均在胁迫24 h 时达到峰值，肾组织在96 h 时MDA 含量趋于稳定，肝组织则在7 d 时达到新稳态，鳃组织在7 d 内仍未恢复正常水平。淡水对照组3 种组织中MDA 含量分别为18.63～22.55、13.05～18.89和8.33～11.32 nmol/mg prot，在整个实验过程中变化不大(P＞0.05)。此外，MDA 含量在肾组织中略高于肝和鳃组织，其在肝、肾和鳃组织中的变化范围分别为17.02～55.98、13.05～57.27 和8.33～53.93 nmol/mg prot。

图4 盐度胁迫对大鳞鲃肝、肾和鳃组织MDA 含量的影响Fig.4 Effects of salinity stress on MDA content in liver,kidney and gill of Luciobarbus capito

2.5 盐度胁迫对大鳞鲃血清皮质醇的影响

由图5 可知，大鳞鲃血清皮质醇浓度在胁迫初期同一胁迫时间下，随盐度的升高呈显著升高的变化趋势(P＜0.05)；在同一盐度条件下，随着胁迫时间的延长，大鳞鲃血清皮质醇呈先上升后下降，并趋于平稳的变化趋势。血清中的皮质醇浓度在胁迫24 h 时达到峰值，在盐度胁迫48 h 时趋于平稳；盐度胁迫组大鳞鲃血清皮质醇浓度为197.00～355.5 ng/L。而淡水对照组血清皮质醇则为197.00～209.00 ng/L，其在整个实验过程中含量变化差异不大。此外，血清皮质醇的浓度变化与盐度呈正相关。

图5 盐度胁迫对大鳞鲃血清皮质醇浓度的影响Fig.5 Effects of salinity stress on serum cortisol concentration in L. capito

3 讨论

ACP 和AKP 的磷酸化和去磷酸化主要作用于机体解毒过程，是衡量机体免疫机能的重要指标(Sarà et al, 2008)。本研究发现，12 g/L 高盐胁迫组中大鳞鲃肝、肾和鳃中ACP 和AKP 活力均高于其他3 个低盐度组，表明盐度越高，机体代谢强度越大，参与调控机体相关酶类磷酸化和去磷酸化过程的ACP 和AKP 活性也越高，徐力文等(2008)对军曹鱼(Rachycentron canadum)在盐度胁迫下的研究也得出相同结论。在相同盐度下，胁迫初期大鳞鲃3 种组织中ACP 和AKP 活力显著上升，并在24 h 内达到顶峰，胁迫48 h 后逐步下降并趋于平缓；但不同盐度胁迫下，最终恢复平稳的时间不同，高盐度组恢复稳定的时间显著长于低盐组；此外，不同组织ACP 和AKP活力恢复稳定的时间也不同，其中，肝组织中ACP和AKP 活力分别在7 d 和4 d 达到新稳态，肾组织中2 种酶的活力均在48 h 达到平稳状态，而鳃组织AKP活力在胁迫96 h 后恢复稳定。肾组织中ACP 和AKP活力范围分别为1.42～2.15 U/g prot 和1.01～1.87 金氏单位/g prot，其在3 种组织中活性最高，且恢复时间最短，而肝组织中酶活力恢复稳定的时间则晚于肾组织，这可能与肝组织需要持续为机体提供能量有关。此外，鳃中酶活力范围分别为0.98～1.96 U/g prot 和0.13～0.84 金氏单位/mg prot，鳃组织ACP 和AKP 活力恢复所需时间亦较长，这可能与鳃直接接触盐度环境且酶活力较低有关系。

GSH-Px 是机体用于清除过氧化物的一种酶，能以GSH 为特异性底物降解过氧化氢和有机过氧化物，对维持细胞膜结构和功能的完整性具有重要的保护作用(Arthur, 2000)。本研究结果显示，大鳞鲃肝、肾和鳃3 种组织在高盐度胁迫下(12 g/L)的同一时间，GSH-Px 活力显著高于低盐度组，且盐度变化与GSH-Px 活力呈正相关性；推测在高盐胁迫下，机体代谢调控强度加大，为避免机体产生的过氧化氢和有机过氧化物对机体造成二次损伤，GSH-Px 活力也相应增强，这与孙鹏等(2010)的报道一致。在相同盐度条件下，胁迫初期大鳞鲃3 种组织中GSH-Px 活力显著上升，其肝组织和肾组织在24 h 达到顶峰，而鳃组织则在6 h 达到峰值，在胁迫48 h 后逐步下降并趋于平稳；高盐度组恢复稳定的时间明显长于低盐度组；此外，3 种组织中GSH-Px 活力最终恢复稳定的时间不同，肝组织中GSH-Px 活力在7 d 达到新稳态，而肾和鳃均在96 h 恢复稳定；此外，肝组织中GSH-Px活力最高，肾和鳃次之。肝是机体代谢供能的主要组织，其在机体盐度适应过程中需要高强度持续供能，产生的过氧化代谢废物多，因此，GSH-Px 在活力和恢复稳定所需时间均显著强/长于肾、鳃组织。

MDA 是生物体脂质代谢过程中一种重要的脂质过氧化产物，是衡量机体内活性氧的水平和氧化应激程度的重要指标之一(Paust et al, 2011)。本研究发现，盐度胁迫初期，相同时间下高盐度组(12 g/L)大鳞鲃肝、肾和鳃组织中MDA 含量明显高于低盐度组，且盐度越高，机体代谢产生的MDA 越多，这与杨静雯等(2019)对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)在盐度胁迫下的结论一致。相同盐度条件下，胁迫初期大鳞鲃3 种组织中MDA 含量呈显著上升趋势，并在24 h 达到最高，胁迫48 h 时逐步下降并基本趋于平稳；此外，肾组织中MDA 含量略高于肝和鳃组织。推测在盐度胁迫下，3 种组织中脂质物质均参与了分解供能过程，但这一结论仍需进一步的研究证实。

皮质醇是在下丘脑–垂体–肾上腺轴(HPI)分泌的促肾上腺皮质激素作用下，由头肾细胞合成与释放的一种糖皮质类固醇激素，是反应鱼体应激强度的重要指标(Zong et al, 2019)。本结果显示，盐度胁迫下的血清皮质醇在高盐胁迫下(9 和12 g/L)显著高于低盐胁迫(3 和6 g/L)，且皮质醇浓度随盐度的上升而上升，这与胡静等(2016)的报道相一致。在同一盐度下，大鳞鲃血清皮质醇在短期内急速上升，并在24 h 时升至峰值，表明在鱼体刚接触盐度环境时，大鳞鲃的肾间组织受到刺激并分泌大量的皮质醇，但随着胁迫时间的延长，到48 h 时，大鳞鲃逐渐适应了水体盐度环境，其血清中皮质醇含量亦逐渐恢复至正常水平。

综上所述，本研究中，3 种组织中抗氧化酶活力、MDA 含量以及血清皮质醇，均在24 h 内出现最大值，并在48 h 之后逐渐趋于平稳，推测大鳞鲃在刚进入盐度环境时，鱼体对外界环境产生了剧烈反应，在曝露24 h 内机体抗氧化能力逐步达到最强，之后随着时间的延长，鱼体逐步适应相应的盐度环境，其抗氧化能力也随之恢复到正常水平，各指标均基本趋于平稳。整个实验过程中未出现大鳞鲃死亡现象，且在12 g/L 高盐胁迫下3 种组织中各项指标均能恢复稳定水平，表明大鳞鲃对于高盐水体环境具有较强的适应性，且能够在12 g/L 高盐环境下中正常生长。