抗IL-1β卵黄抗体对大菱鲆生长性能、生理生化指标的影响

2021-03-18郭培红田丹阳孙丙耀寇海燕宋学宏

饲料工业 2021年4期

郭培红田丹阳孙丙耀何稳寇海燕宋学宏*

（1.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123；2.贝瑞康生物科技有限公司，山东潍坊261061）

卵黄抗体（egg yolk immunoglobulin，IgY）是在抗原物质的刺激下由禽类B 淋巴细胞产生并转移到卵黄中的多克隆抗体。卵黄抗体具有化学性质稳定、特异性强、制备简单、成本低、口服安全等优点，并在功能性食品、生物制品及兽药领域得到了广泛应用[1-3]。白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是一种促炎细胞因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生。IL-1β在机体内是一种内源性发热源，可参与机体的多种生理及病理反应，可通过触发和加强免疫及炎症反应从而调节很多炎症反应，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节过程中起重要的作用[4]。

大菱鲆（Scophthatmus maximus）属于鲽形目鲆科菱鲆属，在国内俗称“多宝鱼”，是产于欧洲的一种冷水性海产鲆鲽类。其生长迅速，耐低温，适合高密度养殖，经济价值高，自1992年引进我国，目前成为我国海水养殖的一个支柱产业，工业化养殖规模居全球之首[5]。然而，在当今集约化高密度养殖模式下，大菱鲆极易受到细菌、病毒和寄生虫的感染，普遍造成炎症反应，产生各种疾病；近年来随鱼粉资源及价格的限制，植物蛋白在海水鱼类饲料中的使用越来越普遍，由此引发的肠道炎症也逐渐引起了人们的重视[6～9]。与此同时，在全民关注食品安全的今天，以化学药剂、抗菌素等药物为主要病害防治手段导致的耐药菌株、药物残留、环境污染等诸多问题也越来越引起人们的重视。因此，寻求符合环境友好、水产品质量安全、可持续发展战略的病害防治措施成为水产养殖业发展的主要方向。

本试验所用卵黄抗体，是利用大菱鲆IL-1β融合蛋白（rsmIL-1β）为抗原免疫蛋鸡产生的卵黄抗体，并经水稀释结合纳米材料的方法得到的生物制品。将抗大菱鲆IL-1β卵黄抗体添加到大菱鲆基础饲料中进行饲养试验，通过观察该卵黄抗体对大菱鲆生长性能和免疫保护力的影响，以期为大菱鲆的工厂化健康养殖提供参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

健康的大菱鲆（约510 g）购自苏州南环桥水产批发市场。克隆用大肠杆菌DH5α株、原核表达载体pET32a(+)、表达用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS 株均购自上海生工生物有限公司；克隆载体pMD19-T、限制性内切酶EcoR I/Xho I 购自TaKaRa 公司。重组表达载体构建所采用的引物IL1βF(5'-GGA GAA TTC ATG GAA TAC AAC ATG GAG TGC-3')和IL1βR(5'-ACT CTC GAG GTA AAT CTG ACG CTG GAT GCT-3')由苏州金唯智生物科技有限公司合成。养殖试验用健康大菱鲆幼鱼[体重（14.80±0.38）g]由山东莱州明波水产有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 pET32a(+)-IL-1β表达载体的构建

采用RNAiso Plus 试剂盒（TaKaRa 公司）提取大菱鲆脾脏总RNA，并采用TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）产生cDNA；以cDNA为模板，IL-1βF 和IL-1βR 特异引物进行PCR 扩增。对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]回收、纯化特异性PCR产物，经TA克隆法连接至pMD19-T载体，送苏州金唯智生物科技有限公司测序鉴定。将测序鉴定正确的目的片段经EcoR I/Xho I双酶切后插入表达载体pET32a(+)质粒，获得重组表达质粒pET32a(+)-IL-1β。

1.2.2 大菱鲆重组IL-1β蛋白(rsmIL-1β)的原核表达和纯化

将表达载体pET32a(+)-IL-1β转化E. coli BL21(DE3 pLysS)感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB 液体培养基中振荡过夜培养，取培养物按1∶100的比例接种到2YT诱导培养基（氨苄青霉素终浓度100 μg/mL）中，37 ℃条件下，220 r/min振荡培养2 h后，在培养物中加入IPTG至终浓度1 mmol/L，28 ℃、100 r/min培养4 h；离心收集细胞，进行12% SDS-PAGE分析。

诱导表达的菌体经高压细胞破碎仪（北京迪索仪器有限公司）破碎，离心收集沉淀；将沉淀用含7 mol/L 尿素的变性缓冲液充分溶解；离心得上清液；Ni-NTA 亲和层析柱进行纯化（蛋白质高压制备色谱仪，法国Armen 公司，型号SPOT）；用Milipore 超滤系统（美国Milipore 公司）将洗脱液进行超滤浓缩，直至洗脱液中不含咪唑及尿素；整个操作在4 ℃条件下进行。最终获得纯化rsmIL-1β蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定蛋白浓度。

1.2.3 蛋鸡免疫

在生物安全隔离条件好、饲养管理科学规范、鸡群健康的某鸡场选择100 羽具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋鸡（海兰蛋鸡，130 日龄）作为试验鸡群，饲养管理按照海兰蛋鸡产蛋期饲养管理要求进行。蛋鸡首次免疫采用弗氏完全佐剂苗（购自Sigma 公司），此后免疫采用弗氏不完全佐剂苗，rsmIL-1β与佐剂1∶1 混合，鸡胸肌与颈部皮下注射免疫，剂量为0.5 mL/只。同样剂量和方法免疫3次，第1次与第2次间隔10 d，第2次与第3次间隔30 d。第1 次接种后从第20 d 开始抽检鸡蛋中抗体效价，每次抽检10 个样本，每个样本由3 枚鸡蛋混合而成，每7 d抽检一次。

1.2.4 卵黄抗体的制备

收集抗体效价达到1∶5 000 以上的免疫蛋，鸡蛋消毒，收集蛋黄，加入一定比例的pH 值为5.1 的磷酸盐缓冲溶液，搅拌均匀，离心得上清，即为制得的卵黄抗体。同样方法制备普通鸡蛋IgY 作为阴性对照。

1.2.5 卵黄抗体的效价测定

以rsmIL-1β作为检测抗原，以普通鸡蛋IgY作为阴性对照，PBS 为空白对照，用间接ELISA法检测所制备的卵黄抗体效价：用碳酸盐缓冲液（CBS：0.05 mol/L，pH 值9.6）稀释纯化的rsmIL-1β至3 μg/mL，包被96孔酶标板，37 ℃温育1.5 h，4 ℃过夜；10%脱脂牛奶37 ℃封闭2 h；每1 mL卵黄抗体加入200 μg Trx总蛋白，室温预结合1 h后按不同倍数稀释待检；二抗为羊抗鸡辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（Thermo Fish⁃er，1∶2 500 稀释）；邻苯二胺显色底物（OPD，北京百灵威科技有限公司）；2 mol/L 的H2SO4终止反应。用酶标仪（Bio-Tek，美国）在492 nm处读取OD值。

1.2.6 卵黄抗体的特异性鉴定

菌体总蛋白及纯化rsmIL-1β蛋白经12% SDSPAGE 分离后，转至PVC 膜，分为A、B 膜，10%脱脂奶粉封闭；孵一抗：A膜为卵黄抗体，B膜为预结合的卵黄抗体（每1 ml卵黄抗体加入200 μg Trx总蛋白，室温预结合1 h），一抗浓度均为1∶2 500稀释；二抗为羊抗鸡辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（Sigma，1∶2 500 稀释）；DAB（上海碧云天生物科技有限公司）显色，纯化水终止反应。

1.2.7 卵黄抗体的添加方法及大菱鲆饲养管理

大菱鲆养殖试验在山东莱州明波水产有限公司进行。基础饲料为大菱鲆专用商业饲料（青岛七好生物科技有限公司，粗蛋白50%、粗脂肪12%），对照组饲料添加0.6%的普通鸡蛋IgY，试验组饲料按0.1%、0.2%、0.4%、0.6%的剂量在基础饲料中添加卵黄抗体，方法为将普通鸡蛋IgY 和卵黄抗体均匀拌在基础饲料表面，待充分吸收后风干并于阴凉干燥处保存备用。

试验用鱼经消毒处理，饲养驯化2 周后，挑选体质健康、个体大小均匀的幼鱼600尾，随机分配于20个养殖桶（200 L，5 个试验组，每组4 个重复），每桶30 尾。对5组鱼初始体重进行方差整齐性分析，组间差异不显著后，开始正式试验，试验期间的水温(16±1.0) ℃，盐度(28±1)，pH 值为7.2～7.5，溶氧＞8 mg/L。日投饵3次（8：00、14：00和20：00），饱食投喂，每天投饲量为鱼体重的2%左右，每次投喂过程持续30 min，之后吸取残存饵料，65 ℃烘干称重且从投饲量中扣除残饲。根据鱼体重量及摄食情况，及时调整投喂量。试验过程中每天吸污并换水1/3 左右，若出现死鱼，及时捞出并称重记录。

1.2.8 采样及分析方法

在试验结束时停食24 h，用MS-222将鱼麻醉，然后称重取样。

生长指标测定：在试验开始、结束时分别对鱼体称重。计算成活率（SR）、特定生长率（SGR）、增重率（WGR）和饲料系数（FC）。

SR(%)=100×Nt/N0

SGR(%/d)=(lnWt-lnW0)/t×100

WGR(%)=100×(Wt-W0)/W0

FC=F/(Wt-W0)

式中：N0——试验开始时鱼体总尾数（尾）；

Nt——试验结束时鱼体总尾数（尾）；

W0——试验开始时鱼体重（g）；

Wt——试验结束时鱼体重（g）；

t——养殖时间（d）；

F——饲料总摄入量（g）。

血清生理生化指标分析：血清溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

1.2.9 数据处理

试验结果采用“平均值±标准差”表示，采用SPSS17.0 经One-Way ANOVA 分析后进行Duncan's多重比较法分析试验数据的差异显著性，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 大菱鲆IL-1β的基因克隆及rsmIL-1β蛋白的诱导表达（见图1～图2）

图1 大菱鲆IL-1β基因cDNA特异扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

图2 原核表达rsmIL-1β的SDS-PAGE电泳分析

由图1显示，以大菱鲆IL-1β反转录cDNA为PCR模板，采用IL-1βF 和IL-1βR 引物，经扩增获得了大菱鲆IL-1β基因的cDNA 序列特异的产物，其大小与预测大小759 bp相符（黑色箭头所指）。由图2显示，pET32a(+)/BL21经IPTG诱导表达的蛋白分子量介于20～25 kDa之间（泳道3），与Trx分子标签（21 kDa）大小一致；pET32a(+)-IL-1β/BL21经诱导表达的蛋白在50 kDa 处显示出较粗的条带（泳道5），与rsmIL-1β预测大小47.12 kDa吻合。Ni-NTA亲和层析柱纯化后的rsmIL-1β蛋白纯度可达90%以上（泳道6），BCA测定蛋白浓度可达2.18 mg/mL。

2.2 间接ELISA法检测卵黄抗体效价结果（见表1）

以rsmIL-1β作为检测抗原，采用间接ELISA 法检测卵黄抗体效价，结果见表1。阴性对照组（即普通鸡蛋IgY 组）OD 值小于0.1，酶标孔几乎没有颜色，可视为普通鸡蛋IgY 无效价；而卵黄抗体组OD值在0.419～2.452 之间，远大于阴性对照组。ELISA结果为阳性的判定标准为P/N≥2.1，其公式为：P/N=（待测OD 值-阴性对照OD 值）/（阴性对照OD 值-空白对照OD 值）。一般将P/N≥2.1 时所对应的抗体最高稀释倍数作为抗体的效价。当卵黄抗体稀释度至1∶16 000 时，OD 值为0.419，同时阴性对照组OD 值为0.072，P/N 为16.5，因此，可判定卵黄抗体效价为1∶16 000以上。

表1 间接ELISA法检测卵黄抗体效价结果

2.3 卵黄抗体的特异性检测（见图3）

图3 抗大菱鲆IL-1β卵黄抗体的Western blot鉴定

以卵黄抗体为一抗时，泳道中出现IL-1β和Trx蛋白条带，同时还出现非特异性条带，表明所制备的卵黄抗体中除含有抗IL-1β和Trx 蛋白的IgY 外，还存在能够识别其他蛋白的IgY（见图3A）。以Trx 总蛋白预结合卵黄抗体作为一抗时，图中仅于50 kDa左右出现一条带，即IL-1β条带（见图3B），表明Trx总蛋白能够封闭卵黄抗体中除抗IL-1β以外的其他IgY，证明了卵黄抗体中存在能够特异性识别IL-1β蛋白的IgY。

2.4 卵黄抗体对大菱鲆生长性能的影响（见表2）

由表2 显示，与对照组相比，添加不同剂量的卵黄抗体对大菱鲆的成活率、特定生长率、增重率及饲料系数均有不同程度的影响。成活率、特定生长率和增重率随卵黄抗体添加水平的增加均呈现先提高后降低的趋势，且当添加水平在0.2%～0.4%时达到了最高值，显著高于对照组（P＜0.05）；而与对照组相比，当添加水平达到0.6%时差异不显著（P＞0.05）。饲料系数随卵黄抗体添加水平的提高呈先下降后上升趋势，与对照组相比，0.1%、0.2%添加组和0.4%添加组均显著性降低（P＜0.05），而0.6%添加组与对照组相比略有提高，未达到显著性水平（P＞0.05）。结果显示，卵黄抗体在大菱鲆饲料中的适宜添加量是0.2%～0.4%。

表2 卵黄抗体对大菱鲆生长性能的影响

2.5 卵黄抗体对大菱鲆血清生理生化指标的影响（见表3）

由表3 显示，与对照组相比，饲料中添加卵黄抗体能显著降低大菱鲆血清中MDA 含量（P＜0.05）；当添加0.2%卵黄抗体时，大菱鲆血清SOD活性及LSZ 活性均得到显著性提高（P＜0.05）；当添加水平在0.4%时，大菱鲆血清中GPT 活性和GOT活性显著性降低（P＜0.05）；而当卵黄抗体含量达到0.6%时，除MDA 外，试验组各项血清生化指标与对照组相比均无显著性差异（P＞0.05）。由此得出，卵黄抗体在大菱鲆饲料中的适宜添加量是0.2%～0.4%。

表3 卵黄抗体对大菱鲆血清生理生化指标的影响

3 讨论

鱼类生活环境复杂，极易受到细菌、病毒、内毒素等各种致炎因子刺激，导致机体免疫器官及皮肤、鳃、肠道等组织中IL-1β转录水平明显上调[10]。IL-1β作为一种促炎介质，其传递信息、激活和调节免疫细胞、介导淋巴细胞分化，在炎症反应过程中起到重要作用。研究表明，IL-1β过多分泌会产生炎症风暴，对机体组织造成不同程度的伤害[11]，此过程机体消耗大量能量，造成鱼类食欲下降，饲料利用率低，产量及品质降低等一系列问题。因此，我们制备了IL-1β抗体，与鱼体IL-1β特异结合，从而降低IL-1β的分泌量，减少鱼体的损伤并降低能耗，促进鱼类生长，因而可为鱼类养殖带来潜在的经济效益。

卵黄抗体性质稳定，能够有效地通过动物口腔和食道，在肠道发挥作用，同时还可以在消化酶作用下降解成易被肠道吸收的具有免疫活性的小肽（Fab），转运至血液黏附病原体，或与宿主血液中的球蛋白末端结合使其免遭机体破坏[12-13]。中华人民共和国农业农村部发布饲料“禁抗”令（第194号公告），明确要求2020年7月1日起严禁使用含促生长类药物饲料添加剂。在此大背景下，卵黄抗体以其效应快，一经输入立即获得免疫力的特点；同时具有性质稳定（可常温长期保存）、口服使用方便、无毒性、无致突变性、产量高、成本低[1-3]；不与哺乳动物及水产动物发生交叉血清学反应及补体系统反应、不结合类风湿因子或Fc受体[14]；营养全面、富含生物活性物质、诱食性强[15-17]等优势，更是在水产动物疾病的防治中发挥重要的作用[18-24]，具有较好的应用前景。本研究制备的抗大菱鲆IL-1β的卵黄抗体，不仅保留了较高的生物活性（抗体效价高达1∶16 000 以上），同时兼具极佳的稳定性，可直接用作饲料添加剂。

已有研究发现，将灭活的嗜水气单胞菌免疫产蛋鸡，其得到的卵黄加入一定比例的赋形剂干燥后按0.2%的比例添加到中华鳖日粮中，发现中华鳖日增重比对照组和0.2%无特异IgY 添加组分别提高21.73%和7.24%，摄食时间分别缩短24.15%和26.06%，饲料系数分别降低13.55%和5.6%[24]。本试验也得到相似的效果：卵黄抗体的添加可使大菱鲆的成活率提高2.5%～5.3%；特定生长率提高1.3%～11.1%；增重率提高3.1%～18.6%；饲料系数下降10.3%～16.4%（0.6%添加组除外）。适量添加卵黄抗体能促进大菱鲆生长的原因可能是其抑制了大菱鲆肠道炎症过度发生，改善肠道健康，促进生长[25]；而过量添加后机体炎症被过度抑制，反而影响大菱鲆机体生长及生理机能。本研究还发现，添加抗IL-1β的卵黄抗体后大菱鲆血清溶菌酶活性随添加量的增加呈先上升后下降的趋势，当添加量为0.2%时显著高于对照组（P＜0.05），说明适量添加卵黄抗体可以提升大菱鲆的溶菌酶免疫功能，但过量添加反而会抑制其功能，其原因可能是大菱鲆IL-1β被过度抑制后影响到了免疫细胞间的信号传递，具体机理有待进一步研究。

细胞在正常和病理情况下均能产生活性氧，过多的活性氧能引起机体组织的氧化应激，MDA 是脂质过氧化产物，其含量反映了上皮细胞的氧化损伤程度[26]。本研究表明添加卵黄抗体能显著降低大菱鲆血清中MDA含量（P＜0.05），添加量在0.1%～0.2%时含量最低，随着添加量的提高MDA含量也略有提高，试验组之间差异不显著（P＞0.05）。SOD 是机体内活性氧的重要抗氧化酶。本研究发现，大菱鲆血清中SOD活性随着卵黄抗体含量的提高呈先增强后减弱趋势，其中0.2%添加组和0.4%添加组活性显著高于对照组（P＜0.05），0.2%添加组达到峰值。这与血清中MDA含量趋势基本一致，表明卵黄抗体有助于提高机体清除体内自由基的能力，这与卵黄抗体抑制了机体炎症发生有关，具体机理有待研究。

转氨酶是催化氨基酸和酮酸之间氨基转移的酶，主要存在于肝细胞中，是反映肝功能的重要指标，当肝细胞损伤时会释放到血液中，导致血清中转氨酶活性偏高[27]。本研究中，GPT 活性和GOT 活性均呈现先下降后上升的趋势，添加0.1%～0.4%的卵黄抗体，能显著降低血清GPT 活性（P＜0.05），但高剂量反而使GPT 活性升高；添加量为0.4%时GOT 活性显著降低（P＜0.05），但与其他添加组差异不显著（P＞0.05）。分析其原因可能是，肠道和肝脏交互影响，药物解毒作用的肠肝循环、胆汁色素的肠肝循环等，生理称为“肠-肝轴”[28]，卵黄抗体抑制了大菱鲆肠道过度炎症的发生，改善肠道健康，从而促进了肝脏健康。