乳酸菌对苜蓿青贮发酵品质和细菌菌群的影响

王 媛， 王雁萍， 赵珊珊， 杨逢源， 郝湘妹， 范小苗*

（1.郑州大学物理学院，河南省离子束生物工程省重点试验室，河南郑州450000；2.郑州大学农学院，河南省离子束生物工程省重点试验室，河南郑州450000）

苜蓿（Medicago sativa）是世界上种植面积最大的栽培植物性蛋白粗饲料（马召稳，2019），叶片中含有较高含量的粗蛋白质以及各种必需氨基酸和多种维生素，有“牧草之王”的美誉（王星凌等，2015）。 苜蓿干草是苜蓿生产的主要产品，但在我国淮河及一些南方地区， 苜蓿收获时正值雨热同期， 晾晒过程中由于雨淋等因素会造成营养物质的流失，难以晒至优质干草（杨玉玺等，2017）。 青贮苜蓿的制作受不利环境的影响较小， 且易于机械化操作，可有效降低田间损失（刘辉，2015），此外青贮苜蓿柔软多汁、气味芳香、适口性较好，各类家畜均喜食（侯健健等，2016）。但苜蓿原料可溶性碳水化合物含量及附着乳酸菌含量不足， 青贮过程中无法有效抑制不良微生物的活动， 易导致营养成分流失，降低发酵品质（史卉玲等，2013）。乳酸菌作为青贮添加剂可有效增加青贮饲料初期发酵时的乳酸菌数量， 保证青贮饲料尽快进入乳酸发酵阶段（李旭娇等，2014）。 因此，可以通过添加乳酸菌青贮来提高青贮苜蓿的发酵品质。

微生物在青贮过程中的作用十分重要， 同时还受到添加剂的种类、 青贮条件以及附生微生物等因素的影响（Guan 等，2018；Kasmaei 等，2017）。目前， 随着高通量测序技术的不断完善以及测试费用的降低， 高通量测序技术已经广泛应用到检测包括青贮环境在内的各种环境下的微生物组成（Adams 等，2017）。本文的目的是通过高通量测序技术， 探究乳酸菌作为青贮添加剂对苜蓿青贮细菌菌群和发酵品质的影响， 并对细菌菌群与发酵品质间的相关性进行初步探究。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料及菌株 紫花苜蓿：河南省郑州市（34.76 °N，113.65 °E；海拔110.4 m）刈割的初花期紫花苜蓿。萎焉至合适含水量后用铡刀切为1 ～2 cm 的碎饲料。乳酸菌：乳酸菌YX（台湾亚新生物科技股份有限公司）或ZZU A341（山西苜蓿附生菌株）在MRS 液体培养基中培养12 h，8000 r/min离心10 min， 调整细菌悬液OD600值为0.80 待用（菌落数约为1×106cfu/mL）。

1.2 试验设计 试验共分为3 个处理组：无添加剂对照组（CK 组）和分别添加1×106cfu/g 乳酸菌YX （LPI 组）、乳 酸菌ZZU A341 （LPA 组）。 约500 g 碎饲料与5 mL 细菌悬液（CK 组中需添加5 mL 无菌水）混合均匀，抽真空后在室温（25 °C）下保存，各处理组设置三个重复样本，青贮60 d 后测定其发酵指标、 化学成分以及细菌菌群的组成和相对丰度。

1.3 青贮苜蓿样品处理 苜蓿青贮60 d 后在超净工作台中拆袋处理， 各样本充分混匀后共分为三份样品。 第一份样品将10 g 青贮苜蓿与90 mL无菌水混合均匀， 液体经滤纸与4 层纱布过滤后收集于50 mL 白色密封瓶中， 保存在-20 °C 冰箱，用于测定有机酸、氨态氮等发酵指标。 第二份样品在60 °C 烘箱中烘干至恒重， 用打粉机粉碎后使用40 目筛子过滤，保存于干燥通风处，用于测定样品的干物质 （DM）、 可溶性碳水化合物（WSC）及游离糖成分等。 第三份样品放入干净的自封袋中保存在-20 °C 冰箱，用于提取样品中细菌菌群DNA。

1.4 指标测定及方法

1.4.1 发酵指标 使用pH 计测量各样本的pH，并对测量结果进行记录； 使用高效液相色谱法测定有机酸的含量和种类 （Schwartz 等，1977）；苯酚-次氯酸钠比色法测定各样本中氨态氮 （NH3-N）含量（Bolsem 等，1992）。

1.4.2 化学成分 使用AOAC 法测各样品的干物质（DM）含量；蒽酮-硫酸法（Murphy 等，1958）测定各样品中可溶性碳水化合物（WSC）的含量；样本中游离糖的测定采用离子交换色谱法（HPIC）。

1.4.3 细菌菌群 使用DNA 试剂盒D3350-02（Omega Biotek，Norcross，GA，USA）提取苜蓿青贮60 d 的细菌菌群DNA，质量检查合格后，利用高通量测序技术分析样品中的细菌菌群。

表1 苜蓿原料特性

1.5 数据处理 用Excel 2013 对试验数据进行整理，IBM SPSS（23.0）进行统计分析。运用单因素ANOVA 方差分析法进行差异显著性分析。 用Mothur 方法与SILVA13（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 数据库进行微生物物种注释分析。

2 试验结果

2.1 苜蓿原料特性 青贮前苜蓿样品的pH、DM、WSC、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、麦芽糖含量如表1 所示。 青贮前苜蓿样品中未检测到氨态氮和有机酸。

2.2 发酵指标 由表2 可知， 青贮60 d，CK 组的pH、NH3-N 和乙酸含量显著高于LPI 或LPA 组（P＜0.05），乳酸含量显著（P＜0.05）低于LPI 或LPA 组。

表2 青贮60 d 苜蓿的发酵特性

2.3 化学成分 由表3 可知， 青贮60 d，CK 组的WSC、果糖含量显著低于LPI 或LPA 组（P＜0.05）；鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖含量均低于LPI 组，显著低于LPA 组（P＜0.05）；半乳糖、蔗糖含量显著高于LPI 或LPA 组（P＜0.05）； 木糖含量高于LPI 组，LPA 组中未检测到木糖。

2.4 细菌菌群 根据细菌注释结果，选取门水平和属水平上相对丰度大于1%的细菌菌群， 用于分析各处理组间细菌菌群组成。 结果表明，苜蓿原料中相对丰度较高的细菌菌群有Cyanobacteria/Choroplast 门（36.46%）、Proteobacteria门（31.27%）、Actinobacteria门（18.88%）以及Firmicutes门（11.56%）；青贮60 d 后，各处理组中Firmicutes门相对丰度均增加，成为优势菌门。 属水平上细菌菌群组成，苜蓿原料中相对丰度较高的细菌菌群有Streptophyta属（36.37%）、Massilia属（13.68%）； 青贮后，CK 组或LPI 组的优势菌属为Pediococcus属 （56.40%、98.63%），LPA 组为Lactobacillus属（98.88%）。

表3 青贮60 d 苜蓿的化学成分

3 讨论

青贮原料的DM 含量是影响青贮过程和品质的重要因素之一，DM 含量高于30%可有效降低梭菌发酵的风险（刘辉，2015）；郭玉琴等（2005）研究表明， 含水量在60%左右植物细胞质的渗透压较高，对腐生菌、酪酸菌等会造成一定的生理干燥状态，可有效抑制异常发酵，与本文青贮60 d 各处理组均未检测到丁酸的结果相符。 氨态氮是青贮过程中蛋白质的水解产物， 含量越高表明青贮过程中蛋白质降解越多，发酵品质越差，而且会影响动物的采食量和饲料利用率（李艳芬等，2020）。 乳酸菌作为发酵促进型添加剂可提高青贮饲料的乳酸含量，降低pH 和氨态氮含量（刘辉等，2015）；张金霞等（2014）报道，添加乳酸菌有利于青贮环境中pH 的降低。本试验中LPI 或LPA 组乳酸积累量显著高于CK 组，pH 和氨态氮含量显著低于CK 组，且pH 均降至5.00 以下， 表明乳酸菌作为青贮添加剂可有效提高青贮苜蓿的发酵品质。

细菌菌群的组成对苜蓿发酵品质有显著影响。McElhiney 等（2001）称Cyanobacteria能够产生导致细胞死亡的微囊藻毒素， 青贮60 d 后，Cyanobacteria/Choroplast门的相对丰度降低，可有效降低其产生的不利影响。 青贮后Firmicutes门成为各处理组中的优势菌门， 与Eikmeyer（2013）、Keshri 等（2018）研究结果一致。本试验中，CK 组或LPI 组的优势菌属为Pediococcus属，Lactobacillus属是LPA 组的优势菌属，Li 等（2019）研究报道称Pediococcus属对低pH 的耐受性低于Lactobacillu属，与本试验LPA 组具有较低的pH 相符。WSC 是青贮过程中微生物发酵的主要底物， 充足的WSC含量是保证发酵过程中有益微生物正常繁殖代谢的关键因素之一（Daniel 等，2013）。 添加蔗糖青贮可加速乳酸发酵，快速降低青贮环境的pH，改善发酵品质（王亚楠，2017 ）。 本试验中，青贮后各处理组中蔗糖含量与青贮前相比均呈下降趋势，CK 组显著高于LPI 组或LPA 组，可能是乳酸发酵不足，底物残留量较多， 与其具有较低的乳酸积累量相符。乳酸菌添加剂具有分解纤维素或半纤维素的潜力， 能够改善青贮过程中的WSC 及单糖含量不足的问题，本研究青贮60 d 后，LPA 组的葡萄糖含量显著高于CK 组或LPI 组，可能与其具有一定的纤维分解能力有关（王媛等，2020；Guo 等，2019）。 综上所述，乳酸菌作为青贮添加剂能够通过调控青贮过程中细菌菌群的组成或相对丰度，进而达到改善其发酵品质的目的。