Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ在良性转归葡萄胎和恶性变葡萄胎中的表达及意义

韦婵妍 黄琼华

葡萄胎是来源于受精卵的异常受精，是一类良性的妊娠滋养细胞疾病（gestational trophoblastic disease，GTD），多数葡萄胎在吸宫后病灶自然消退，但是具有一定的恶变潜能，能发展成为侵蚀性葡萄胎和绒毛膜癌、上皮样滋养细胞肿瘤、胎盘部位滋养细胞肿瘤等［1-3］。关于葡萄胎恶变的机制仍不明确，目前临床上主要通过检测葡萄胎清宫术后血人绒毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）水平来预测葡萄胎恶变，但葡萄胎清宫术后hCG 随访不能严格执行，且hCG 随访具有时间滞后性，部分葡萄胎患者确诊恶变时已出现远处转移甚至是子宫破裂［4-5］。因此对于首次清宫术诊断葡萄胎的患者，如何判断其预后及转归是亟待解决的难题。近年来研究［6］显示，葡萄胎恶变与Wnt 信号转导通路调控有关，Wnt 信号通路相关蛋白可能是预测葡萄胎转归的潜在标志物，但目前相关系统研究尚缺乏。本研究检测葡萄胎首次清宫组织中Wnt/Ca2+通路的相关蛋白无翅型MMTV 整合位点家族成员5a（wingless-type MMTV integration site family,member 5A，Wnt-5a）、无翅型MMTV 整合位点家族成员（wingless-type MMTV integration site family member，Wnt-11）及Ca2+/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（Ca2+-calmodulin dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）表达，并探讨其预测葡萄胎恶变的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选 取2009年3月至2020年3月 本院72例葡萄胎患者为研究对象，平均年龄（32.84±6.42）岁。纳入标准：①符合葡萄胎的诊断标准［7］，并经病理确诊；②临床病理资料完整；③年龄18～45 岁。④所有患者均知情并同意；排除标准：①清宫前接受化疗的患者；②随访时间不足6 个月者。入选的72例葡萄胎患者中，28例随访发生恶变（恶变葡萄胎组），44例为随访未发生恶变（良性转归葡萄胎组）；收集所有患者首次清宫石蜡标本。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂

兔抗人Wnt-5a、Wnt-11 抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗人CaMKⅡ抗体（（英国abcam 公司），Envision 法免疫组织化学试剂盒（丹麦DAKO 公司），DAB 显色试剂盒（丹麦DAKO 公司），羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2.2 检测方法

免疫组化染色及判定标准石蜡包埋的组织标本4 μm 连续切片至过胶玻片上，56℃条件下烤片2 h，使用二甲苯连续脱蜡3 次，梯度乙醇脱二甲苯，水洗。0.3%过氧化氢室温孵育以阻断内源性过氧化物酶的活性。采用免疫组化Envision 法染色，染色步骤严格按说明书要求进行，采用DAB显色，严格控制显色时间，常规脱水、封片。使用已知阳性切片作为阳性对照，PBS 替代Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ一抗作为阴性对照。显微镜下随机选取5 个切片视野（×200），再从各视野中观察100 个细胞，采用病理Path 软件分析显微镜下细胞分布情况。Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ均定位于细胞质，以细胞质染色强度结合阳性细胞百分比对其表达情况进行判读［8］。

1.3 统计学方法

使用SPSS 20.0 软件进行数据统计分析，计数资料用n（%）表示，采取χ2检验；葡萄胎恶变的独立危险因素采用多因素Logistic 回归模型分析；应用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线及曲线下面积（area under the curve，AUC）评价各指标的诊断效能，AUC 比较使用Z检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Wnt-5a、Wnt-11及CaMKⅡ蛋白表达比较

恶变葡萄胎组Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ蛋白阳性表达率均显著高于良性转归葡萄胎组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 恶变葡萄胎组和良性转归葡萄胎组临床特征比较

年龄、卵巢黄素化囊肿、宫腔病变径线与葡萄胎是否恶变相关（P＜0.05），孕周、滋养细胞增生程度、血β-hCG 与葡萄胎恶变无关（P＞0.05）。见表2。

表2 恶变葡萄胎组和良性转归葡萄胎组临床特征比较［n（%）］Table 2 Comparison of clinical features between malignant hydatidiform mole group and benign conversion hydatidiform mole group［n（%）］

2.3 葡萄胎恶变影响因素的多因素Logistic 回归分析

以葡萄胎是否发生恶变作为因变量（1=恶变，0=良性转归），表1和表2中差异有统计学意义的变量作为自变量纳入多因素Logistic 回归分析，结果显示宫腔病变径线≥6 cm、Wnt-5a 阳性、Wnt-11阳性及CaMKⅡ蛋白阳性是葡萄胎恶变的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 葡萄胎恶变影响因素的多因素Logistic 回归分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of the influencing factors of hydatidiform mole

2.4 ROC 曲线分析Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ及宫腔病变径线对葡萄胎恶变的预测价值

绘制葡萄胎患者首次清宫组织中Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ蛋白及宫腔病变径线预测葡萄胎恶变的ROC 曲线。Wnt-11 预测葡萄胎恶变的的AUC 分别大于宫腔病变径线（Z=3.481，P=0.000）、CaMKⅡ（Z=2.822，P=0.005）。预测的AUC与Wnt-5a预测的AUC 比较，差异无统计学意义（Z=1.804，P=0.071）。见图1、表4。

图1 Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ蛋白预测葡萄胎恶变的ROC 曲线Figure 1 ROC curves of Wnt-5a，wnt-11 and CaMKⅡproteins in predicting malignant transformation of hydatidiform mole

表4 Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ及宫腔病变径线预测葡萄胎恶变的效能比较Table 4 Comparison of the efficacy of Wnt-5a，wnt-11，CaMK Ⅱand uterine cavity lesion diameter in predicting malignant transformation of hydatidiform mole

3 讨论

葡萄胎发生恶变的原因尚不清楚，一般认为是同一种疾病的不同发展阶段［9-10］。葡萄胎恶变后具有强大的破坏力，很早便可通过血行远处转移，若能早期发现葡萄胎恶变并给予预防性化疗，其预后通常更好［11-12］。既往研究［13］显示，葡萄胎大小与葡萄胎恶变倾向具有密切联系，病变越大，发生恶变的可能也越大。

非经典Wnt 信号通路在胚胎早期发育中体轴的建立、中胚层的模式形成及随后的器官发生中起重要作用，该通路异常与众多器官发育畸形有关，此外在多种癌症中可发现其不同程度的过表达［14］。在非经典Wnt 信号通路中，Wnt-5a 是最重要的激活因子之一，Wnt-5a 在激活Wnt/Ca2+信号通路，发挥生物学功能过程中发挥重要作用。既往报道指出敲除Wnt-5a 基因的小鼠有严重的四肢缺陷，Wnt-5a 在雌性哺乳类动物的生殖道发育中发挥重要作用［15］。Wnt-11 是另外一个重要的Wnt/Ca2+信号通路激活因子，作为非经典信号通路的代表性配体，Wnt-11 可以调控细胞的增殖、分化和迁移继而决定细胞的命运［16］；另外Wnt-11 能促使细胞泛素化，导致黏附蛋白的降解及逆转，为细胞的迁移奠定了基础。本研究结果提示葡萄胎患者首次清宫组织中Wnt-5a、Wnt-11 过表达可能与葡萄胎恶变相关。本研究经多因素Logistic回归分析提示Wnt-5a、Wnt-11 阳性表达是的葡萄胎恶变的独立危险因素，Wnt-5a、Wnt-11 可能是预测葡萄胎恶变的潜在生物标志物。为进一步评价首次清宫组织中Wnt-5a、Wnt-11 在预测葡萄胎恶变中的价值。

在Wnt/Ca2+信号通路中，Wnt 蛋白通过与细胞膜上相应的Frizzled（Fz）家族受体结合后通过一系列信号传递最终引起胞浆内质网Ca2+的释放，使得细胞内钙离子水平瞬间升高，同时细胞内Ca2+的增加可以进一步活化CaMKII，活化的CaMKI 继续激活其下游通路，来发挥生物学功能［17］。本研究结果表明其对预测葡萄胎恶变有一定价值。

综上所述，恶变葡萄胎首次清宫组织中Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ蛋白表达较良性转归葡萄胎异常升高，三者对葡萄胎恶变具有较好的预测价值，在葡萄胎清宫时便可提示其是否有恶变倾向。本研究不足在于纳入样本数量较小，可能影响结果的统计效能，更全面、准确的结果尚需要进行大样本研究论证。