基于网络药理学探讨猫爪草治疗肺结核的作用机制

刘向芳，王 璐，陈 洁，孙 辉，陆绍玉，刘 幸

（昆明市第三人民医院药学部，昆明 650041）

肺结核是临床常见疾病，也是发病率最高的结核病，属于一种慢性传染性疾病。目前常见的肺结核治疗方法是应用抗结核药物如异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺，虽然在治疗中发挥良好的药效，但长期使用这些药物，毒副作用不可避免，易产生耐药性，给患者带来沉重的经济负担〔1〕。肺结核在中医上属于“肺痨”范畴〔2〕，寻找新的抗痨药物是未来研究的热点。治疗肺结核的机制主要是抑制和杀灭结核分枝杆菌。

猫爪草为毛莨科植物小毛莨（Ranunculus ternatusThunb.）的干燥块根，具有抗菌消炎、消肿解毒、化痰散结等功效，临床上常用于治疗偏头痛、牙痛、咽喉肿痛、肺结核等疾病，现代研究表明猫爪草具有抗肿瘤、抑菌、保肝、抗氧化等作用，并对耐药肺结核患者有较好的疗效〔3-5〕，具有较强的细胞内外抗结核作用，对结核杆菌具有较强的抑制作用。猫爪草是昆明市第三人民医院自拟“抗痨补肺汤”的主要成分，抗痨补肺汤主要通过滋阴补肺、抗菌杀菌，优化了血液流变学，抑制细菌的繁殖生长，提高了肺部的抗菌能力〔6-7〕。虽然已有部分研究表明，猫爪草具有多系统的药理作用，但是单味中药具有较多的活性成分和多靶点的功效，且中药的活性成分间具有协同作用的特点，因此，从单一的系统作用去阐述猫爪草的药理作用，阐述并不全面。

目前，网络药理学是一门新兴的学科领域，主要建立在药理学的基础上，基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，可以反映化合物与靶点之间的复杂相互作用，从而更直观理解中药和机体间的相互作用，提高药物的治疗效果，减少不良反应的发生。本研究旨在利用网络药理学对猫爪草治疗肺结核机制进行研究，更科学地阐述猫爪草的现代药理作用机制，为更有针对性地深入探索猫爪草的药理作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 数据库和软件TCMSP数据库（http：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php）；UniProt 数 据 库（http：∕∕www.uniprot.org∕）；GeneCards 数据库（http：∕∕www.genecards.org）；STRING 数据库（https：∕∕string-db.org∕）；Bioconductor数据库（http：∕∕www.bioconductor.org∕）；Perl软件（https：∕∕www.perl.org∕）；R 软件（https：∕∕www.r-project.org∕）；Cytoscape 3.6.1软件（http：∕∕www.cytoscape.org∕）。

1.2 猫爪草活性成分筛选及潜在靶点预测将“猫爪草”输入TCMSP 数据库检索框中，限定词为“Herb name”，搜索猫爪草所含活性成分，依据TCMSP 数据库官网推荐，以口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 为筛选条件。同时通过TCMSP 数据库的成分靶点预测模型，获得猫爪草的靶点，利用Perl软件在Uniprot 数据库中提取活性成分对应的靶基因，限定物种为“Homo Sapiens”。

1.3 肺结核靶点筛选通过GeneCards数据库搜索肺结核疾病相关基因，在搜索框中以“tuberculosis”为关键词，进行搜索，获得已经报道的肺结核相关基因（即疾病靶点），去除假阳性基因，与猫爪草的活性成分靶点进行匹配生成韦恩图，从而获得共同靶点。

1.4 猫爪草“活性成分-作用靶点”网络的构建根据猫爪草的活性成分及预测的靶点，建立“活性成分-作用靶点”的相互对应关系。将活性成分与靶点作为网络中的节点（node），制成后缀为txt 的文本文档，导入Cytoscape 3.6.1 软件中，构建猫爪草“活性成分-作用靶点”网络图。

1.5 蛋白互作（PPI）网络构建将共同靶点基因传至STRING 数据库中，其物种为“Homo Sapiens”，去除离散的点，构建猫爪草的PPI网络图。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析将交集基因传至Bioconductor 数据库，运用R 软件进行基因本体的GO 功能和KEGG 通路富集分析。此过程中，限定物种为“Homo Sapiens”，以P值反应生物功能的显著性及通路的富集程度，P＜0.05 表示该富集结果具有显著性；P值越小，其显著性越高。

2 结果

2.1 中药活性成分及对应靶点筛选结果通过TCMSP 数据库共检索到猫爪草化学成分79 个，496个靶点。以OB ≥30%和DL ≥0.18为筛选条件，从而获得化学成分12 个，见表1。首先利用Perl 软件提取12 个化学成分的对应靶点，再在UniProt 数据库中找出化学成分对应的靶基因名称，物种限定为“Homo Sapiens”，去除重复的基因，共获得40 个 靶点基因，分别为ADH1C、ADRA1A、ADRA1B、ADRA2A、ADRB1、ADRB2、AKR1B1、BAX、BCL2、CASP3、CASP8、CASP9、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRNA2、CTRB1、GABRA1、JUN、KCNH2、LTA4H、MAOA、MAOB、MAP2、NCOA1、NCOA2、NR3C2、OPRM1、PGR、PLAU、PON1、PRKCA、PTGS1、PTGS2、RXRA、SCN5A、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4。

2.2 肺结核靶点筛选结果通过GeneCards 数据库搜索，去除假阳性基因，共获得2 316 个疾病基因。根据上述“2.1”所获得猫爪草活性成分靶点基因40 个和疾病肺结核靶点基因2 316 个，通过绘制韦恩图获得共同靶点基因14 个，分别为ADRB2、PTGS2、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、PLAU、LTA4H、MAOA。见图1。

表1 猫爪草活性成分筛选结果

图1 药物靶点与疾病靶点韦恩图

2.3 猫爪草“活性成分-作用靶点”网络图构建将猫爪草的活性成分及作用靶点输入软件Cytoscape 3.6.1，构建“活性成分-作用靶点”网络图。见图2。其中三角形图标为活性成分，椭圆形图标为作用靶点，菱形图标为疾病，六边形图标为药物。

图2 猫爪草“活性成分-作用靶点”网络图

2.4 PPI 网络图构建将“2.2”所获得的14 个共同靶点基因传至STRING数据库进行PPI分析，去除孤立点，该网络包括14 个节点、27 条边，平均节点度为3.86，其中节点间相互关系评分前20位见表2。

表2 节点间相互关系的评分

2.5 GO 功能分析将“2.2”共同靶点基因传至Bioconductor数据库，运用R软件对猫爪草靶点进行GO 功能分析，阈值设置P＜0.05，共得到GO 条目14个，主要包括生物过程、分子功能、细胞成分，结果见表3，并将其可视化展示，结果见图3。

2.6 KEGG 信号通路分析KEGG 富集分析，阈值设置P＜0.05，得到20 条信号通路，以P值大小为条件进行筛选，并将其可视化展示，结果见图4，前10条信号通路及其涉及的基因见表4。猫爪草治疗肺结核的机制包括细胞凋亡、p53 信号通路、IL-17 信号通路。其中与肺结核相关的通路为细胞凋亡、p53 信号通路、IL-17 信号通路，对应基因为BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8、JUN。

3 讨论

猫爪草1977年开始收载于《中华人民共和国药典》〔8〕，属于毛茛科植物小毛茛的干燥块根，该药为一种非常用草药，性温、味甘辛，具有消肿散结、清热解毒的功效，现今逐步发现猫爪草用于治疗肿瘤、淋巴结核和肺结核等疾病，疗效显著，特别是对耐药肺结核患者具有较好疗效〔5-7〕。近年来有研究表明猫爪草具有抗肿瘤、抗结核、免疫调节功能、抗氧化等多种活性，是因为猫爪草活性成分中皂苷类具有抗肿瘤作用，甾醇类具有抗结核、抑菌作用，其抑菌作用较异烟肼稍强，多糖类具有抗氧化、减轻和修复肝损伤及保肝作用、机体免疫调节功能〔6-9〕。

本研究通过TCMSP 数据库共检索到猫爪草活性成分12 个，其中有对应作用靶点的活性成分为5个。由猫爪草“活性成分-作用靶点”网络图可见，上述5 个活性成分作用于14 个靶点，体现了中药治疗疾病多成分、多靶点的特点。有研究已证实，猫爪草作为一种新的抗结核药，不仅能有效地抑制结核分枝杆菌，还可增强患者的机体免疫力，改善患者肺部血液循环和病灶周围的营养，对耐药菌株有一定疗效，并可以抑制持留结核菌，从而更有效地治疗肺结核〔10〕。有研究发现，猫爪草中的多糖、皂苷成分可使吞噬百分率、吞噬指数显著升高，还可显著促进溶血素的形成并提高外周血中T淋巴细胞的数量，可能通过减少结核分枝杆菌HspX 蛋白表达水平，影响结核菌的正常代谢发挥抑菌作用〔11〕。猫爪草“活性成分-作用靶点”网络中，节点度最高的是β-谷甾醇，其次是豆甾醇，猫爪草的醇提取物可增强耐多药结核病（MDR-TB）感染小鼠的细胞免疫功能，通过促进GLS mRNA 的表达，增强机体细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）杀菌能力，从而达到抗结核休眠菌的作用，醇提取物中的吡咯丁酸4-［formyl-5-（hydroxymethyl）-1H-pyrrol-1-yl］butanoicacid 对结核分枝杆菌标准株（H37Rv）、耐多药菌株（MDR）、广泛耐药株（XDR）均具有较强的抑制作用〔9〕，而其余三种活性成分与肺结核相关性的报道不多，可作为学者后续研究的重点之一。猫爪草“活性成分-作用靶点”网络中排名前5 位的靶蛋白分别为CASP3、ADRB2、CASP8、CASP9、PTGS2。陈柯宇等〔12〕研究发现，CASP3 可抑制肺腺癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡的分子机制。有研究表明，ADRB2这个基因的变化与支气管及血管反应都有一定的相关性，可能在某种程度上影响疾病的发生和发展过程〔13〕。CASP8 是死亡受体凋亡通路的重要起始型蛋白酶。马明等〔13〕研究发现CASP9 广泛表达于人类的正常组织，如神经组织、肝脏、胃和肺等，且参与线粒体介导的凋亡途径。PTGS2 能够促进细胞凋亡、阻滞细胞迁移、黏附及抑制血管生成，在炎症、各种癌症的治疗中发挥着很大的作用。鉴于上述靶蛋白在机体炎症、肿瘤、肺功能等方面产生作用，笔者认为其可能成为猫爪草治疗肺结核的相关靶点。

表3 GO功能分析结果

图3 GO功能分析图

图4 KEGG信号通路富集分析图

表4 KEGG信号通路分析结果

从韦恩图可知，猫爪草与肺结核的交集基因共14 个，提示猫爪草对肺结核的治疗具有多靶点协同作用的特点。PPI 网络共包含14 个节点、27 条边，平均节点度为3.86，说明这些交集基因的编码蛋白之间相互作用紧密。

GO 分析结果显示，疾病的靶点主要是针对生物过程，涉及半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、死亡受体结合、泛素蛋白连接酶结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合等，提示这些生物过程在治疗疾病中起到了关键作用。KEGG 通路富集分析发现，猫爪草与肺结核最相关的通路包括细胞凋亡、p53信号通路等。其中细胞凋亡通路涉及的靶点基因为BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8；p53信号通路涉及的靶点基因为BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8。有研究表明，BCL2基因表达可抑制肝癌HepG2 细胞增殖及侵袭，促进其凋亡〔13〕；BAX 抑制传递线粒体的抗凋亡信号，在鼠急性肾损伤（AKI）模型中能够减轻肾衰竭、炎症和肾小管死亡〔14〕；在顺铂处理后，CASP9 与细胞凋亡和抗性有关〔15〕；CASP8 是细胞凋亡的外在途径所必需的蛋白酶，在细胞死亡中起着双重作用，其中在肿瘤细胞死亡和耐药性中起重要作用〔16〕；CASP3 可对肺癌组织较癌旁组织凋亡分子进行调节，它可能成为进行药物干预的分子标志物和靶点〔17〕；JUN 是ATP 刺激的血管生成基因表达的必需因子〔18〕。由上述研究可知，与肺结核通路相关的基因包括BCL2、BAX、CASP9、CASP8、JUN、CASP3，它们可能是猫爪草活性成分发挥治疗肺结核作用的靶点。此外，本研究挖掘出ADH1C、ADRA1A、ADRA1B、ADRA2A等其他靶点基因，也可作为后续的研究对象。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法探讨了猫爪草的活性成分，猫爪草中的豆甾醇、β-谷甾醇等有效化合物可能通过细胞凋亡、p53信号通路、IL-17 信号通路，作用于BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8等靶点，进而发挥对肺结核的治疗作用，呈现多成分、多靶点和多通路的特点。除已有报道的活性成分外，还有一些有潜在治疗作用的活性成分以及靶点蛋白，可作为后续研究的重点之一，可为猫爪草治疗肺结核及实验验证研究奠定良好的基础。