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基于网络药理学探讨猫爪草治疗肺结核的作用机制

2021-03-18刘向芳陆绍玉

大理大学学报 2021年2期
关键词:靶点肺结核通路

刘向芳,王 璐,陈 洁,孙 辉,陆绍玉,刘 幸

(昆明市第三人民医院药学部,昆明 650041)

肺结核是临床常见疾病,也是发病率最高的结核病,属于一种慢性传染性疾病。目前常见的肺结核治疗方法是应用抗结核药物如异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺,虽然在治疗中发挥良好的药效,但长期使用这些药物,毒副作用不可避免,易产生耐药性,给患者带来沉重的经济负担〔1〕。肺结核在中医上属于“肺痨”范畴〔2〕,寻找新的抗痨药物是未来研究的热点。治疗肺结核的机制主要是抑制和杀灭结核分枝杆菌。

猫爪草为毛莨科植物小毛莨(Ranunculus ternatusThunb.)的干燥块根,具有抗菌消炎、消肿解毒、化痰散结等功效,临床上常用于治疗偏头痛、牙痛、咽喉肿痛、肺结核等疾病,现代研究表明猫爪草具有抗肿瘤、抑菌、保肝、抗氧化等作用,并对耐药肺结核患者有较好的疗效〔3-5〕,具有较强的细胞内外抗结核作用,对结核杆菌具有较强的抑制作用。猫爪草是昆明市第三人民医院自拟“抗痨补肺汤”的主要成分,抗痨补肺汤主要通过滋阴补肺、抗菌杀菌,优化了血液流变学,抑制细菌的繁殖生长,提高了肺部的抗菌能力〔6-7〕。虽然已有部分研究表明,猫爪草具有多系统的药理作用,但是单味中药具有较多的活性成分和多靶点的功效,且中药的活性成分间具有协同作用的特点,因此,从单一的系统作用去阐述猫爪草的药理作用,阐述并不全面。

目前,网络药理学是一门新兴的学科领域,主要建立在药理学的基础上,基于系统生物学的理论,对生物系统的网络分析,可以反映化合物与靶点之间的复杂相互作用,从而更直观理解中药和机体间的相互作用,提高药物的治疗效果,减少不良反应的发生。本研究旨在利用网络药理学对猫爪草治疗肺结核机制进行研究,更科学地阐述猫爪草的现代药理作用机制,为更有针对性地深入探索猫爪草的药理作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 数据库和软件TCMSP数据库(http:∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php);UniProt 数 据 库(http:∕∕www.uniprot.org∕);GeneCards 数据库(http:∕∕www.genecards.org);STRING 数据库(https:∕∕string-db.org∕);Bioconductor数据库(http:∕∕www.bioconductor.org∕);Perl软件(https:∕∕www.perl.org∕);R 软件(https:∕∕www.r-project.org∕);Cytoscape 3.6.1软件(http:∕∕www.cytoscape.org∕)。

1.2 猫爪草活性成分筛选及潜在靶点预测将“猫爪草”输入TCMSP 数据库检索框中,限定词为“Herb name”,搜索猫爪草所含活性成分,依据TCMSP 数据库官网推荐,以口服利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18 为筛选条件。同时通过TCMSP 数据库的成分靶点预测模型,获得猫爪草的靶点,利用Perl软件在Uniprot 数据库中提取活性成分对应的靶基因,限定物种为“Homo Sapiens”。

1.3 肺结核靶点筛选通过GeneCards数据库搜索肺结核疾病相关基因,在搜索框中以“tuberculosis”为关键词,进行搜索,获得已经报道的肺结核相关基因(即疾病靶点),去除假阳性基因,与猫爪草的活性成分靶点进行匹配生成韦恩图,从而获得共同靶点。

1.4 猫爪草“活性成分-作用靶点”网络的构建根据猫爪草的活性成分及预测的靶点,建立“活性成分-作用靶点”的相互对应关系。将活性成分与靶点作为网络中的节点(node),制成后缀为txt 的文本文档,导入Cytoscape 3.6.1 软件中,构建猫爪草“活性成分-作用靶点”网络图。

1.5 蛋白互作(PPI)网络构建将共同靶点基因传至STRING 数据库中,其物种为“Homo Sapiens”,去除离散的点,构建猫爪草的PPI网络图。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析将交集基因传至Bioconductor 数据库,运用R 软件进行基因本体的GO 功能和KEGG 通路富集分析。此过程中,限定物种为“Homo Sapiens”,以P值反应生物功能的显著性及通路的富集程度,P<0.05 表示该富集结果具有显著性;P值越小,其显著性越高。

2 结果

2.1 中药活性成分及对应靶点筛选结果通过TCMSP 数据库共检索到猫爪草化学成分79 个,496个靶点。以OB ≥30%和DL ≥0.18为筛选条件,从而获得化学成分12 个,见表1。首先利用Perl 软件提取12 个化学成分的对应靶点,再在UniProt 数据库中找出化学成分对应的靶基因名称,物种限定为“Homo Sapiens”,去除重复的基因,共获得40 个 靶点基因,分别为ADH1C、ADRA1A、ADRA1B、ADRA2A、ADRB1、ADRB2、AKR1B1、BAX、BCL2、CASP3、CASP8、CASP9、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRNA2、CTRB1、GABRA1、JUN、KCNH2、LTA4H、MAOA、MAOB、MAP2、NCOA1、NCOA2、NR3C2、OPRM1、PGR、PLAU、PON1、PRKCA、PTGS1、PTGS2、RXRA、SCN5A、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4。

2.2 肺结核靶点筛选结果通过GeneCards 数据库搜索,去除假阳性基因,共获得2 316 个疾病基因。根据上述“2.1”所获得猫爪草活性成分靶点基因40 个和疾病肺结核靶点基因2 316 个,通过绘制韦恩图获得共同靶点基因14 个,分别为ADRB2、PTGS2、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、PLAU、LTA4H、MAOA。见图1。

表1 猫爪草活性成分筛选结果

图1 药物靶点与疾病靶点韦恩图

2.3 猫爪草“活性成分-作用靶点”网络图构建将猫爪草的活性成分及作用靶点输入软件Cytoscape 3.6.1,构建“活性成分-作用靶点”网络图。见图2。其中三角形图标为活性成分,椭圆形图标为作用靶点,菱形图标为疾病,六边形图标为药物。

图2 猫爪草“活性成分-作用靶点”网络图

2.4 PPI 网络图构建将“2.2”所获得的14 个共同靶点基因传至STRING数据库进行PPI分析,去除孤立点,该网络包括14 个节点、27 条边,平均节点度为3.86,其中节点间相互关系评分前20位见表2。

表2 节点间相互关系的评分

2.5 GO 功能分析将“2.2”共同靶点基因传至Bioconductor数据库,运用R软件对猫爪草靶点进行GO 功能分析,阈值设置P<0.05,共得到GO 条目14个,主要包括生物过程、分子功能、细胞成分,结果见表3,并将其可视化展示,结果见图3。

2.6 KEGG 信号通路分析KEGG 富集分析,阈值设置P<0.05,得到20 条信号通路,以P值大小为条件进行筛选,并将其可视化展示,结果见图4,前10条信号通路及其涉及的基因见表4。猫爪草治疗肺结核的机制包括细胞凋亡、p53 信号通路、IL-17 信号通路。其中与肺结核相关的通路为细胞凋亡、p53 信号通路、IL-17 信号通路,对应基因为BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8、JUN。

3 讨论

猫爪草1977年开始收载于《中华人民共和国药典》〔8〕,属于毛茛科植物小毛茛的干燥块根,该药为一种非常用草药,性温、味甘辛,具有消肿散结、清热解毒的功效,现今逐步发现猫爪草用于治疗肿瘤、淋巴结核和肺结核等疾病,疗效显著,特别是对耐药肺结核患者具有较好疗效〔5-7〕。近年来有研究表明猫爪草具有抗肿瘤、抗结核、免疫调节功能、抗氧化等多种活性,是因为猫爪草活性成分中皂苷类具有抗肿瘤作用,甾醇类具有抗结核、抑菌作用,其抑菌作用较异烟肼稍强,多糖类具有抗氧化、减轻和修复肝损伤及保肝作用、机体免疫调节功能〔6-9〕。

本研究通过TCMSP 数据库共检索到猫爪草活性成分12 个,其中有对应作用靶点的活性成分为5个。由猫爪草“活性成分-作用靶点”网络图可见,上述5 个活性成分作用于14 个靶点,体现了中药治疗疾病多成分、多靶点的特点。有研究已证实,猫爪草作为一种新的抗结核药,不仅能有效地抑制结核分枝杆菌,还可增强患者的机体免疫力,改善患者肺部血液循环和病灶周围的营养,对耐药菌株有一定疗效,并可以抑制持留结核菌,从而更有效地治疗肺结核〔10〕。有研究发现,猫爪草中的多糖、皂苷成分可使吞噬百分率、吞噬指数显著升高,还可显著促进溶血素的形成并提高外周血中T淋巴细胞的数量,可能通过减少结核分枝杆菌HspX 蛋白表达水平,影响结核菌的正常代谢发挥抑菌作用〔11〕。猫爪草“活性成分-作用靶点”网络中,节点度最高的是β-谷甾醇,其次是豆甾醇,猫爪草的醇提取物可增强耐多药结核病(MDR-TB)感染小鼠的细胞免疫功能,通过促进GLS mRNA 的表达,增强机体细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)杀菌能力,从而达到抗结核休眠菌的作用,醇提取物中的吡咯丁酸4-[formyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]butanoicacid 对结核分枝杆菌标准株(H37Rv)、耐多药菌株(MDR)、广泛耐药株(XDR)均具有较强的抑制作用〔9〕,而其余三种活性成分与肺结核相关性的报道不多,可作为学者后续研究的重点之一。猫爪草“活性成分-作用靶点”网络中排名前5 位的靶蛋白分别为CASP3、ADRB2、CASP8、CASP9、PTGS2。陈柯宇等〔12〕研究发现,CASP3 可抑制肺腺癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡的分子机制。有研究表明,ADRB2这个基因的变化与支气管及血管反应都有一定的相关性,可能在某种程度上影响疾病的发生和发展过程〔13〕。CASP8 是死亡受体凋亡通路的重要起始型蛋白酶。马明等〔13〕研究发现CASP9 广泛表达于人类的正常组织,如神经组织、肝脏、胃和肺等,且参与线粒体介导的凋亡途径。PTGS2 能够促进细胞凋亡、阻滞细胞迁移、黏附及抑制血管生成,在炎症、各种癌症的治疗中发挥着很大的作用。鉴于上述靶蛋白在机体炎症、肿瘤、肺功能等方面产生作用,笔者认为其可能成为猫爪草治疗肺结核的相关靶点。

表3 GO功能分析结果

图3 GO功能分析图

图4 KEGG信号通路富集分析图

表4 KEGG信号通路分析结果

从韦恩图可知,猫爪草与肺结核的交集基因共14 个,提示猫爪草对肺结核的治疗具有多靶点协同作用的特点。PPI 网络共包含14 个节点、27 条边,平均节点度为3.86,说明这些交集基因的编码蛋白之间相互作用紧密。

GO 分析结果显示,疾病的靶点主要是针对生物过程,涉及半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程、死亡受体结合、泛素蛋白连接酶结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合等,提示这些生物过程在治疗疾病中起到了关键作用。KEGG 通路富集分析发现,猫爪草与肺结核最相关的通路包括细胞凋亡、p53信号通路等。其中细胞凋亡通路涉及的靶点基因为BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8;p53信号通路涉及的靶点基因为BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8。有研究表明,BCL2基因表达可抑制肝癌HepG2 细胞增殖及侵袭,促进其凋亡〔13〕;BAX 抑制传递线粒体的抗凋亡信号,在鼠急性肾损伤(AKI)模型中能够减轻肾衰竭、炎症和肾小管死亡〔14〕;在顺铂处理后,CASP9 与细胞凋亡和抗性有关〔15〕;CASP8 是细胞凋亡的外在途径所必需的蛋白酶,在细胞死亡中起着双重作用,其中在肿瘤细胞死亡和耐药性中起重要作用〔16〕;CASP3 可对肺癌组织较癌旁组织凋亡分子进行调节,它可能成为进行药物干预的分子标志物和靶点〔17〕;JUN 是ATP 刺激的血管生成基因表达的必需因子〔18〕。由上述研究可知,与肺结核通路相关的基因包括BCL2、BAX、CASP9、CASP8、JUN、CASP3,它们可能是猫爪草活性成分发挥治疗肺结核作用的靶点。此外,本研究挖掘出ADH1C、ADRA1A、ADRA1B、ADRA2A等其他靶点基因,也可作为后续的研究对象。

综上所述,本研究通过网络药理学的方法探讨了猫爪草的活性成分,猫爪草中的豆甾醇、β-谷甾醇等有效化合物可能通过细胞凋亡、p53信号通路、IL-17 信号通路,作用于BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8等靶点,进而发挥对肺结核的治疗作用,呈现多成分、多靶点和多通路的特点。除已有报道的活性成分外,还有一些有潜在治疗作用的活性成分以及靶点蛋白,可作为后续研究的重点之一,可为猫爪草治疗肺结核及实验验证研究奠定良好的基础。

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