分心木提取物对大鼠HIRI的保护作用初探

王永宽，田新雁，苏 娟，庞 博，周 萍*

（1.大理大学药学院，云南大理 671000；2.大理大学基础医学院，云南大理 671000）

肝缺血-再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝脏缺血一段时间后再恢复血流灌注，再灌注不但没有使肝脏结构、功能恢复，反而使损伤程度加重的现象〔1〕。HIRI 是肝移植、休克复苏、严重肝外伤及肝叶切除等过程中不可避免的，严重时可导致肝功能衰竭，甚至死亡，是肝移植术后肝功能衰竭的主要原因〔2〕。目前，已有大量关于HIRI发生机制的研究，其中认为自由基氧化应激损伤是其重要的机制之一〔3〕，需要有效的方法来预防或减轻这种肝损伤。

分心木（Diaphragma juglandisFructus）是胡桃科胡桃属核桃（Juglans regiaL.）果核内的木质隔膜，含有大量的生物活性物质，如酚酸类、黄酮类、萜类、多糖类等，具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗炎、抗微生物、抗诱变、免疫调节和保护心血管等功能，被广泛用于治疗腹泻、肾虚、失眠遗精、血尿、保肝和子宫出血等〔4-7〕。分心木提取物的体外研究已发现其乙酸乙酯部位酚酸类成分具有较好的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基及超氧阴离子清除能力，并能有效抑制黄嘌呤氧化酶（XOD）的活性，体内研究发现其在大鼠125 mg∕（kg·d）的灌胃剂量下，具有较好的抗氧化活性，且无明显毒副作用〔8-9〕。

分心木作为核桃加工过程中的副产物，资源丰富，但目前主要用作燃料或直接丢弃，浪费资源。本研究用分心木乙酸乙酯部位提取物预处理大鼠HIRI 模型，以观察其对HIRI 的保护作用及机制，为深入研究开发利用分心木的药用价值提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料分心木乙酸乙酯部位提取物实验室自制；丙氨酸氨基转移酶（ALT）测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、一氧化氮（NO）测试盒、XOD 测试盒和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒均购自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白质定量试剂盒购自天根生化科技有限公司；同型半胱氨酸（Hcy）测定试剂盒购自上海泛柯实业有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器JR-30鼠恒温实验台（成都泰盟软件有限公司）；TGL-18R冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；Haier 超低温保存箱（海尔股份有限公司）；VCX130超声细胞粉碎仪（美国SONICS&MATERIALS公司）；HH-2 数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；GL-88B 旋涡混合器（海门其林贝尔仪器有限公司）；T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；BioTek Synergy HT多功能酶标仪（基因有限公司）；OLYMPUS BX53 荧光显微镜（上海土森视觉科技有限公司）。

2 方法

2.1 实验动物分组与给药30 只同一批次的SPF级SD 雄性大鼠，体质量为（200±20）g，购自于昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（滇）2015-0002，随机编号分为空白组（S组）、缺血-再灌注组（I∕R 组）和给药组（DJ 组）3 组，每组10 只。适应性饲养7 d 后，DJ 组灌胃分心木乙酸乙酯部位提取物125 mg∕（kg·d）〔9〕，S组和I∕R 组灌胃给予同等剂量的0.9%氯化钠溶液，连续给药14 d后造模。

2.2 HIRI模型建立造模前12 h内禁食不禁水。用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（0.6 mL∕100 g），并将其固定于鼠台上，控制体温（37±0.5）℃，下腹正中切口，暴露出肝门三静脉。根据刘俊平等〔10〕的方法，I∕R 组和DJ 组采用无创血管夹夹闭左外侧叶和中叶的肝动脉、门静脉，阻断入肝约70% 血流90 min，S 组仅行肝蒂骚扰，90 min 后缝合腹部切口两层。继续饲养24 h后取材，于-80 ℃冻存备用。

2.3 肝组织病理学变化取一部分左外肝叶组织，4%多聚甲醛固定，苏木精-伊红（HE）染色法制备4 μm厚切片，镜下观察肝组织病理损伤变化。

2.4 肝功能指标测定按照试剂盒说明书步骤，取肝组织匀浆上清液，先采用BCA 法测定蛋白浓度，再用紫外可见分光光度计测组织匀浆中AST和ALT的OD值并计算活力。

2.5 肝组织生化指标检测根据试剂盒说明书依次测定肝组织中MDA、SOD、XOD、NO、GSH-Px 和Hcy的OD值并计算相应酶活力及含量。

2.6 数据统计分析应用SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析处理，计量资料以（xˉ±s）来表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠HIRI 建模情况通过HIRI 建模，可见肝颜色由鲜红变为暗红，再恢复供血24 h，其间颜色恢复即初步判定造模成功。见图1。

图1 大鼠肝脏缺血前、后情况

3.2 肝组织病理变化HE染色结果显示，S组肝脏肝细胞形态正常，排列整齐，中央静脉清晰完整。见图2A。I∕R 组肝窦受挤压消失，肝索结构紊乱，肝细胞水肿，变性，且出现大量炎性细胞浸润。见图2B。DJ组肝组织病理形态较I∕R组均有不同程度的改善，肝细胞水肿、变性、坏死和炎性细胞浸润减轻，说明大鼠在分心木的预处理下，能减轻HIRI。见图2C。

图2 大鼠肝组织病理变化（HE染色，×200）

3.3 大鼠肝功能的变化AST 和ALT 活力是反映肝组织损伤程度的重要标志。与S组相比，I∕R 组大鼠肝组织中AST 和ALT 酶活力均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。而与I∕R 组相比，DJ组大鼠肝组织中AST 和ALT 酶活力均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 大鼠肝组织中AST和ALT的活力变化（xˉ± s，U∕gprot）

3.4 大鼠肝脏氧化指标的变化与S 组相比，I∕R组大鼠肝组织中XOD 的活力明显升高，SOD 和GSH-Px 的活力明显降低，MDA 和NO 含量升高，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。而与I∕R组相比，DJ 组大鼠肝组织中XOD 的活力明显降低，SOD 和GSH-Px 的活力均升高，MDA 和NO 含量降低，差异均有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表2。

3.5 大鼠肝脏中Hcy 含量的变化与S 组相比，I∕R组大鼠肝组织中Hcy 含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。而与I∕R 组相比，DJ 组大鼠肝组织中Hcy含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 大鼠肝组织中XOD、SOD、GSH-Px活力及MDA、NO、Hcy含量的变化（xˉ± s）

4 讨论

HIRI是一个多因素参与的复杂病理生理过程，其中氧化应激作为参与HIRI的一个重要途径，主要通过活性氧（ROS）的大量产生参与HIRI 发生的过程，在HIRI 中起到关键作用。当发生HIRI 时活化的Kupffer 细胞和肝细胞以及内皮窦细胞氧化呼吸链减少，产生大量ROS 如超氧阴离子和过氧化氢（H2O2）等〔11-12〕。当机体无法清除体内多余ROS 时，生物膜发生脂质过氧化反应，使细胞结构改变并导致其功能代谢障碍等，其代谢产物如MDA等可破坏膜的完整性，使膜脆性增加，细胞内外物质交换发生障碍，影响膜的正常功能，导致细胞及组织广泛性损伤〔13〕。

细胞内XOD 是HIRI 时形成ROS 的重要来源。肝脏缺血时，胞内ATP 代谢为次黄嘌呤在缺血肝组织中大量堆积，随着供氧中断，引起ATP 耗竭，Na+-K+-ATP泵功能失调，Na+聚集胞内激活Na+∕Ca2+逆向转运蛋白，导致Ca2+进入胞内增多，促使大量的黄嘌呤脱氢酶快速转化为XOD。当血流再灌注时，大量的O2分子随血流进入缺血组织与XOD 催化，使次黄嘌呤代谢为黄嘌呤的氧化反应加速，进而使再灌注组织内ROS 迅速增加，超出机体的清除能力从而加重组织损伤〔14〕。

Hcy是一种具有细胞毒性的含硫氨基酸，是心脑血管疾病的独立危险因子，与多种疾病的发生发展相关〔15〕。当肝脏功能不全或受损时，会导致机体糖类、脂质类及氨基酸等代谢障碍，其中Hcy代谢也将会受阻〔16〕。随着Hcy 水平的不断升高，心脑血管疾病的危险度也随之增加。Hcy的巯基在重金属离子（如Fe3+或Cu2+）的催化下易发生氧化应激反应，生成超氧化物、H2O2及羟自由基等活性氧损伤细胞。Hcy巯基的自身氧化，会促进ROS生成，ROS与NO发生反应，并使其失活；Hcy 还会干扰谷胱甘肽（GSH）合成，抑制GSH与NO相互作用导致血管损伤等〔17〕。

分心木富含多种类型活性成分，这些活性成分按照极性大小分布于不同部位，在功能上主要体现在抗氧化以及抗菌、抗炎方面。研究〔18〕表明，通过对分心木中单体化合物进行体外抗氧化性能分析，发现没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、咖啡酸等酚酸类成分均具有较好的抗氧化活性，并且研究发现总酚酸含量较高的乙酸乙酯部位具有明显的体内抗氧化效果〔9〕，这为分心木治疗由氧化应激引起的疾病提供了理论依据。

HIRI 的药物预处理是利用药物中某些生物活性物质直接或间接的药理作用来增强细胞或组织对该损伤的耐受性，从而使损伤程度减轻的一种有效防治方法。本研究通过用分心木乙酸乙酯提取物预处理HIRI 大鼠来检测其肝功能指标、氧化指标、Hcy水平及观察组织病理切片，探讨分心木提取物对肝缺血再灌注损伤的抗氧化作用。结果显示，与I∕R 组比较，DJ 组大鼠在用分心木提取物预处理后，AST 和ALT 的活力明显降低，肝组织病理结构损伤均有不同程度改善。说明肝脏缺血-再灌注前给予分心木提取物预处理能改善肝脏的功能，减轻肝细胞的损伤，具有保护肝脏的作用。DJ组大鼠肝组织SOD 和GSH-Px 活力明显升高，MDA 和NO 含量降低，XOD 活力和Hcy 含量显著降低，说明分心木提取物预处理能减轻肝细胞生物膜脂质过氧化反应，减少黄嘌呤氧化途径产生的自由基，减轻Hcy的自身氧化作用，提高抗氧化能力，减轻HIRI。