吡嗪酰胺对小鼠肠道微生物的影响

姜明照，缪志敏，赵莹莹，赖 泳

（大理大学药学院，云南大理 671000）

吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）是合成的烟酰胺的类似物，吡嗪酰胺对结核分枝杆菌具有高度选择性，是结核病一线治疗方案中的关键药物〔1〕。大量临床试验证明吡嗪酰胺对结核分枝杆菌繁殖和生长有显著抑制作用，可将结核病治疗所需时间缩短3 个月〔2〕。然而，吡嗪酰胺长期大剂量用药往往会导致许多不良反应的发生，如肝脏毒性、关节疼痛、过敏、胃肠道反应等〔3〕。

肠道菌群在人体健康中的作用十分重要，与营养吸收及代谢、免疫系统维护息息相关。唐外姣等〔4〕研究表明，肠道菌群失调和多样性下降，引起肝细胞脂质蓄积和肝毒性。此外，陈竹等〔5〕研究表明，结核分枝杆菌感染会引起肠道菌群改变，增加机体对结核分枝杆菌的易感性，而吡嗪酰胺作为抗结核药，可以缓解肠道菌群失调。这表明肠道菌群和药物疗效、不良反应有关。

近几年，肠道菌群与结核病之间的关系受到了较多的关注，虽然吡嗪酰胺治疗结核分枝杆菌感染有较好的效果，但对肠道菌群的影响尚不清楚，目前未见关于吡嗪酰胺调节小鼠肠道菌群作用的研究。本实验主要研究吡嗪酰胺对小鼠肠道菌群结构、组成和代谢功能产生的作用，探讨吡嗪酰胺对肠道微生态的调节作用，为抗结核药物吡嗪酰胺的合理使用提供参考。

1 材料和仪器

吡嗪酰胺（成都锦华药业有限责任公司，批号：H51020877）；粪便基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号：DP328）；Quant-iT™PicoGreen® dsDNA Assay Kit（德 国Calbiochem 公司，批号：P7589）。

雄性昆明种小鼠，4～6 周，体质量18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2014-0011。

NanoDrop 2000 紫外可见分光光度计（美国Thermofisher 公司）；GeneAmp2720 型PCR扩增仪（美国ABI公司）；FLx800 Microplate reader 定量仪器（美国BioTek公司）。

2 方法

2.1 给药方案将吡嗪酰胺溶解于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中，超声振荡后备用。动物适应性饲养1 周后，随机分为3 组，每组10 只：①溶剂对照组（Z），该组小鼠均灌喂等量0.5% CMC-Na；②吡嗪酰胺低剂量组（P15），该组小鼠灌喂吡嗪酰胺15 mg∕（kg·d）；③吡嗪酰胺高剂量组（P30），该组小鼠灌喂吡嗪酰胺30 mg∕（kg·d）。3 组小鼠每天灌喂一次，持续14 d。

2.2 小鼠粪便的采集小鼠粪便的采集采用压迫法，首先固定小鼠，将其尾部提起，用手指轻轻按压小鼠下腹部，收集新鲜粪便于对应的无菌EP 管中，每管分装2～3 颗，避免污染，收集的粪便样本于-80 ℃保存。

2.3 16S rRNA 高通量测序按照粪便基因组DNA提取试剂盒操作说明，提取各组小鼠粪便样品中微生物总DNA。琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的完整性。以能够反映菌群组成和多样性的目标序列为靶点并添加带有条形码特异性的正向引物（5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′）和 反 向 引 物（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）作为扩增引物，对细菌16S rRNA 基因V3～V4 区进行PCR 扩增，并将扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测和磁珠纯化回收。利用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 进行建库，并利用Miseq平台对文库进行高通量测序。

2.4 生物信息学分析使用FLASH 1.2.7软件进行原始测序数据的筛选及质量控制，按97%的序列相似度进行归并和运算分类单位（OTU）划分，通过分析体现群落丰富度Chao1指数以及体现群落均匀度的Shannon多样性指数，进行样本群落Alpha多样性分析；采用QIIME 1.8.0 软件，获得每个样品在门和属分类水平上的组成和丰度分布表；利用Mothur 1.18.0 软件，调用Metastats 统计学算法，比较门和属水平的各个分类单元在组之间的丰度差异，Beta 多样性分析将原始的高维数据（如菌群OTU 丰度矩阵）通过线性变换组合，投影到维度较低的空间坐标系，通过R 3.6.1 软件，对属水平的群落组成结构进行主成分分析（PCA），并且以二维图像描述样本间的自然分布特征，从而量化样本间的差异和相似度。根据已知的微生物基因组数据，对菌群组成的测序数据（16S rRNA 基因的测序结果）进行菌群代谢功能的预测。

2.5 数据处理采用SPSS 22.0 软件对数据进行分析，数据以（xˉ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 OTU 划分及分类以97%相似度的标准聚类，得到3 370 个OTU，其中吡嗪酰胺低剂量组、吡嗪酰胺高剂量组和溶剂对照组独有的数目分别为708、315、1 434，3个组共有的OTU数目为282个。见图1。

图1 P30-P15-Z韦恩图

3.2 吡嗪酰胺对小鼠肠道微生物群Alpha 多样性的影响Alpha 多样性实验结果分析见图2。吡嗪酰胺低剂量组和高剂量组Chao1指数分别是溶剂对照组的73%（P＜0.05）和51%（P＜0.01）；吡嗪酰胺低剂量组和高剂量组Shannon 多样性指数分别是溶剂对照组的94%和81%（P＜0.05）。

图2 吡嗪酰胺对小鼠肠道微生物群Alpha多样性的影响

3.3 不同分类水平的微生物类群统计及吡嗪酰胺对肠道菌群组成差异分析对所有OTU 进行物种归类，3 个组在门水平上均以拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌群，吡嗪酰胺低剂量组菌群中所占比例依次为47.02%、51.46%；在吡嗪酰胺高剂量组菌群中所占比例依次为56.24%、41.65%；在溶剂对照组菌群中所占比例依次为76.14%、20.83%。属水平上吡嗪酰胺低剂量组以拟杆菌属、颤螺旋菌属为主要菌群，所占比例依次为8.42%、1.41%；吡嗪酰胺高剂量组以乳杆菌属、Odoribacter、拟杆菌属为主要菌群，所占比例依次为2.74%、1.20%、1.14%；溶剂对照组以普雷沃菌属、双歧杆菌属为主要菌群，所占比例依次为3.54%、1.81%。见表1～2。

表1 各组优势菌群在门水平上的分布（%）

表2 各组优势菌群在属水平上的分布（%）

吡嗪酰胺低剂量组和高剂量组拟杆菌门丰度与溶剂对照组相比显著下降（60%和73%）。吡嗪酰胺低剂量组和高剂量组厚壁菌门丰度与溶剂对照组相比显著上升（2.55倍和2.05倍）。见图3。

图3 吡嗪酰胺在门水平对肠道菌群组成的影响

3.4 两组间分类组成的差异分析运用Metastats统计学方法对门和属水平的各个分类单元在两组之间的序列量差异进行两两比较。在门和属水平各发现有显著差异的分类单元个数为5、22 个。进一步对各分类单元在各样本（组）内的丰度分布进行研究，并分析上述显著性差异分析结果。见表3。结果表明拟杆菌属和双歧杆菌属等丰度分布存在显著差异。见图4。

表3 样本（组）之间的Metastats两两比较检验结果统计表

图4 样本（组）间差异最显著的前20个分类单元的丰度分布图

3.5 吡嗪酰胺对小鼠肠道微生物群Beta 多样性的影响采用PCA 方法对群落数据结构进行自然分解并通过对样本排序，从而观察样本之间的差异。见图5。以PC1 为标准，吡嗪酰胺低剂量组和高剂量组肠道菌群结构无明显差异，但与溶剂对照组相比，肠道菌群结构有显著性变化。

图5 吡嗪酰胺对小鼠肠道微生物群Beta多样性的影响

3.6 吡嗪酰胺对肠道菌群代谢功能的影响吡嗪酰胺低剂量组和高剂量组氨基酸代谢、能量代谢和多糖代谢显著降低，分别是溶剂对照组的60%（P＜0.01）和64%（P＜0.01）、67%（P＜0.05）和73%（P＜0.05）、78%（P＜0.05）和84%。见图6。

4 讨论

肠道中微生物的变化与粪便菌群的构成密切相关，粪便菌群变化可反映肠道菌群的状态〔6〕。本研究中吡嗪酰胺组在门水平上均以拟杆菌门和厚壁菌门为小鼠肠道的优势菌群，这与Bezirtzoglou等〔7〕研究结果相似。但是吡嗪酰胺组和溶剂对照组优势菌群所占比例不同，进一步深入探究分析了吡嗪酰胺对肠道菌群代谢功能的影响，结果显示吡嗪酰胺能显著降低氨基酸代谢、能量代谢和多糖代谢。本研究通过高通量测序技术对小鼠粪便菌群进行整体分析，探究吡嗪酰胺对小鼠肠道菌群的影响，结果显示Alpha 多样性的Chao1 指数和Shannon多样性指数这两种指标在吡嗪酰胺给药后显著降低，即对肠道菌群微生物的多样性具有显著影响，Beta 多样性的结果也证实了这一点，在服用吡嗪酰胺后，菌群结构明显偏离溶剂对照组。以上结果说明吡嗪酰胺能明显改变肠道菌群结构，有可能会增加肠道菌群失调的风险。

图6 吡嗪酰胺对肠道菌群代谢功能的影响

吡嗪酰胺通过渗入含有结核杆菌的巨噬细胞内，转化为吡嗪酸而发挥抑菌或杀菌的作用〔8〕。吡嗪酰胺常与利福平、异烟肼及乙胺丁醇联用治疗结核病，但其副作用明显，长期大剂量服用易引起肝脏毒性，这一副作用已在临床有表现，然而吡嗪酰胺引起肝损伤的机制仍在探索研究阶段〔9-10〕。吡嗪酰胺组和溶剂对照组小鼠肠道菌群表现出一定的差异，吡嗪酰胺导致乳酸杆菌数量的减少，这提示吡嗪酰胺引起的肠道菌群紊乱与肠道炎症和肝损伤有关〔11〕。此外本研究结果表明相对于溶剂对照组，吡嗪酰胺组的氨基酸、能量和多糖代谢等代谢功能指标均显著降低，这可能与吡嗪酰胺引起的肝损伤相关〔12〕。虽然越来越多的研究〔13-15〕表明肠道菌群失衡在促进肝脏疾病发展过程中也起着关键作用，但是这一毒副作用是否与吡嗪酰胺能够改变肠道微生物的平衡及其代谢功能有关尚需进一步验证。本研究表明吡嗪酰胺对正常小鼠肠道微生物有影响，为进一步探讨其药理作用打开了新视野。