大蒜素对葡萄糖氯己定诱导的大鼠腹膜纤维化的影响

杨小燕 黄朝晖 刘方 夏作勋 赖运波

腹膜透析(PD)已成为终末期肾病(ESRD)的一种主要肾脏替代治疗方式[1-2]。长期PD使腹膜组织暴露于腹膜透析液中，腹膜结构和功能发生改变，使腹膜向纤维化转化，导致腹膜超滤功能和转运功能衰竭。保持腹膜的完整性是目前PD治疗的重要挑战。对腹膜纤维化(PF)的防治被认为是提高PD患者远期预后的主要措施之一[3]。微小RNA-21(miR-21)是一种内源性的非编码小分子，在转录后与信使RNA结合调控多种基因表达[4]，与药物性肾损伤、糖尿病肾病和肾脏纤维化等病理生理过程密切相关[5-7]。大蒜素是从百合科葱属植物大蒜中提取的有效成分，相关研究发现其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤等药理作用[8]。大蒜素在各种疾病中均能发挥功效，如口腔黏膜纤维化[9]、肾脏纤维化[10]等，不良反应较少，但其用于治疗长期PD导致PF的报道较小。因此，本文通过探讨大蒜素对葡萄糖氯己定诱导大鼠PF的影响及其机制，为今后研发治疗手段提供理论与实验基础。

材料与方法

1.材料：实验动物：SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，体重(260±20)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2015-030。实验药物：大蒜素软胶囊(H65020369)购于新疆华世丹药业有限公司。胶原蛋白Ⅲ(Col Ⅲ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad7、磷酸化-细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)和羊抗兔二抗均购于艾博抗(上海)贸易有限公司。大鼠总RNA提取试剂盒(RE-03014)购于Foregene公司；Bulge-LoopTMmiRNA引物(R10031.7)、Bulge-LoopTM实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒均购于锐博生物。实验仪器：BA400Digital数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)、Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)、PIKORed 96 RT-PCR仪、Thermo Scientific Piko Real分析软件(美国Thermo Fisher仪器有限公司)。

2.方法

(1)实验分组及处理：将30只大鼠随机分成空白组、模型组与大蒜素组，每组10只。造模与药物干预条件：模型组与大蒜素组大鼠以10 ml/kg的浓度腹腔注射0.1%葡萄糖氯己定溶液，空白组大鼠腹腔注射等量生理盐水，每天1次，持续21 d后停止腹腔注射，造模完毕。大蒜素组大鼠于实验开始给予大蒜素溶液22 mg/kg灌胃，每天1次，空白组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃，总共持续12周。

(2)大鼠PF测定：造模12周后处死所有大鼠，收集其壁层腹膜。采用苏木素-伊红(HE)与马松(Masson)染色观察大鼠腹膜组织病理情况，评价腹膜组织损伤及纤维化程度。采用图像分析系统测定所采集全部图像的面积与视野面积，计算纤维率。纤维率(%)=视野面积(mm2)/图像面积(mm2)×100%。

(3)免疫组化法检测腹膜组织中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2的表达水平：将固定好的腹膜组织经脱水、石蜡包埋、切片、氧化、封闭，置于Col Ⅲ(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、TGF-β1(1∶1 000)、Smad7(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)一抗中4 ℃孵育过夜，漂洗3遍后，在室温中孵育二抗2 h，再经过显色、苏木素复染、脱水、透明，封片后，采用显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于100倍下观察全部组织，再选取3个视野分别采集400倍显微图像，采集全部图像的光密度和面积，并计算每张图像的平均光密度，选取3张图像的平均光密度计算每例样本的平均光密度。

(4)RT-PCR检测大鼠腹膜组织中miR-21的表达水平：根据试剂盒说明书对各组腹膜组织进行RNA提取与逆转录后，再进行PCR扩增，使用软件分析PCR过程各检测样本的CT值，采用2-△△CT值反映相对miRNA表达水平。

结 果

1.3组大鼠病理形态学观察结果：大蒜素干预12周后HE染色结果显示，与空白组比较，模型组腹膜组织明显增厚，可见肌纤维表面大量纤维组织增生，核多呈卵圆形或长椭圆形，部分结缔组织坏死明显，周围可见数量不等的中性粒细胞及淋巴细胞等炎性细胞浸润。与模型组比较，大蒜素组腹膜组织增厚减轻，成纤维细胞、纤维细胞增生和炎性细胞浸润减少。Masson染色结果显示，与空白组[(2.937±1.776)%]比较，模型组[(34.380±3.783)%]、大蒜素组[(11.710±6.087)%]大鼠纤维率明显提高(P<0.05)；与模型组比较，大蒜素组大鼠纤维率明显降低(P<0.05)。见图1、2。

图1 3组大鼠腹膜组织HE染色结果(A、B、C：×100；D、E、F：×400)：A、D：空白组；B、E：模型组，可见纤维组织增生，炎性细胞聚集，如箭头所示；C、F：大蒜素组

图2 3组大鼠腹膜组织Masson染色结果(×400)：A：空白组；B：模型组；C：大蒜素组

2.3组大鼠腹膜组织中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2表达水平比较：与空白组比较，模型组腹膜组织中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，大蒜素组腹膜组织中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2表达水平明显降低(P<0.05)。见表1、图3。

图3 3组大鼠腹膜组织中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2的表达(免疫组化染色，×400)：A、D、G、J、M：空白组；B、E、H、K、N：模型组；C、F、I、L、O：大蒜素组

表1 3组大鼠腹膜组织中Col Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad7、p-ERK1/2表达水平比较

4.3组大鼠腹膜组织中miR-21表达水平比较:大蒜素干预12周后，与空白组比较(1.010±0.152)，模型组(1.873±0.306)及大蒜素组(1.433±0.288)大鼠腹膜组织中miR-21表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，大蒜素组miR-21表达水平明显降低(P<0.05)。

讨 论

PF是腹膜长期暴露在高浓度透析液下而引起的一种疾病，其主要的病理特征为腹膜细胞受损、出现纤维化样，进而影响腹膜主导的各种生理功能。腹膜间皮细胞在高浓度透析液下，通过增加细胞外基质(ECM)蛋白的合成，减少其降解，导致ECM的积累，加快上皮细胞间质转化，形成纤维化[11]。PF的形成过程十分复杂，涉及多种通路与信号分子，目前主要的治疗手段为改善腹膜透析液生物相容性、西药、基因与中药治疗，其中中草药因为具备多靶点、多途径抗纤维化作用的优点，因此发掘中药-靶基因的治疗模式成为研究热点[12]。

组织纤维化的特点之一是纤维胶原合成增多，纤维组织在HE与Masson染色下会体现出来，同时组织中Col Ⅲ和α-SMA的蛋白含量也会升高[13]。有研究结果表明，大蒜素能通过减轻肝细胞炎症与坏死程度，减少胶原蛋白的生成，恢复肝小叶组织结构，达到缓解肝脏纤维化的效果[14]。本研究使用大蒜素进行干预后发现，腹膜组织中炎性细胞聚集减少，纤维组织与胶原生成减少，Col Ⅲ、α-SMA表达水平降低，说明大蒜素能减缓PF程度，但是其干预机制尚未明确。

MiR是一种长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其中的miR-21被认为是致癌与致纤维化的关键。miR-21可调控TGF-β1的表达，直接影响TGF-β1下游介导的一系列通路，如TGF-β1/Smad纤维化通路和ERK通路[15]。有研究发现miR-21过表达后，可导致TGF-β1-Smad2/3信号通路激活，促进肝纤维化的形成[16]。本实验结果显示，模型组miR-21的表达水平明显升高，与既往研究结果一致[17]，而大蒜素干预后miR-21的表达水平下降，初步说明大蒜素干预产生了抑制miR-21表达的作用，但尚未确定通过干预下游何种通路产生抗纤维化作用。

TGF-β1是诱导纤维化的因子之一，纤维化组织中TGF-β1的表达水平会上升，同时也会进一步激活下游的纤维化通路，如TGF-β1-Smad2/3与ERK通路[18]。因此如何抑制TGF-β1的表达水平成为治疗纤维化的关键。而在TGF-β1-Smad2/3通路中，TGF-β1既可诱导Smad2/3的合成，又能反馈性调控Smad7的形成，其中Smad2/3是纤维化的主要诱导蛋白，而Smad7可抑制Smad2/3的生成[19]。本实验结果明确了大蒜素能抑制miR-21的表达，在对TGF-β1与Smad7的检测后发现，模型组大鼠由于miR-21过表达导致下游的TGF-β1表达水平上升，而大蒜素组大鼠TGF-β1的表达水平下降，证明了miR-21可以影响TGF-β1的表达；同时发现，模型组大鼠中Smad7的表达水平也明显升高，大蒜素组Smad7的表达水平降低，猜测其可能出现的原因是因为TGF-β1主动调节与Smad2/3负反馈调节所致，从侧面印证miR-21能通过TGF-β1-Smad2/3通路介导PF，同时说明大蒜素能通过抑制该通路而起到减轻纤维化的效果。TGF-β1也能通过Ras-MEKs通路使ERK1/2复合受体磷酸化，然后转移至细胞核发挥促纤维化的作用[20]。有研究结果发现，在肝纤维化中，TGF-β1-Smad-ERK1/2信号通路被激活[21]。本实验中，模型组大鼠TGF-β1与p-ERK1/2表达水平上升，而大蒜素组的表达水平下降，说明大蒜素能影响TGF-β1/Smad/ERK信号通路，产生减轻PF的效果。

本研究尚存在局限性：由于PD是人类用于临床治疗肾病的手段，临床疾病与动物模型之间存在一定的差异，目前对PF动物模型成模的公认指标尚未完全明确，对评价某种药物的疗效存在局限性，因此本实验选择的葡萄糖氯己定诱导大鼠PF作为实验模型，不能完全模拟因PD而产生的PF，只能说明大蒜素在这种动物模型下可产生效果；另一方面，本实验只选取了其中一个与PF相关联的miR-21和TGF-β1/Smad/ERK信号通路进行研究，因为TGF-β1/Smad通路与ERK通路之间存在相互影响的关系，只能间接证明大蒜素能通过抑制miR-21对TGF-β1/Smad及ERK信号通路发挥作用，并不足以全面阐述大蒜素抑制PF的作用机制，因此今后我们将会从更多方面去研究大蒜素抑制PF的机制，使大蒜素的干预机制更加明确。

综上所述，大蒜素能减轻葡萄糖氯己定诱导的大鼠PF，其中一个干预机制可能是通过降低miRNA-21的表达，抑制TGF-β1/Smad/ERK信号通路上的部分蛋白，发挥减少纤维胶原合成与纤维组织增生的作用，进而减轻PF程度，这为今后的进一步研究提供了前期基础。