人参皂苷Rg3对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管的影响

郭敬强，林胜璋

人参皂苷Rg3对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管的影响

郭敬强1，林胜璋2*

1. 温州医科大学附属五院，丽水市中心医院，浙江 丽水 323000 2. 浙江树人大学树兰国际医学院附属树兰杭州医院，浙江 杭州 310004

探究人参皂苷Rg3对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成的影响。裸鼠背侧近右后肢处sc胰腺癌SW-1900细胞建立胰腺癌皮下移植瘤模型，将荷瘤裸鼠随机分为对照组及人参皂苷Rg3低、高剂量（10、20 mg/kg）组。给药组ip人参皂苷Rg3，对照组ip 0.9%氯化钠溶液，每2天1次，连续4周。给药结束3 d后裸鼠脱颈椎处死，取瘤组织。采用免疫组化法检测各组裸鼠瘤组织中内皮细胞标记物CD31表达，计算微血管密度；采用qRT-PCR和Western blotting法检测各组裸鼠瘤组织中血管内皮钙黏素（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）、络氨酸激酶受体A2（erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2）mRNA和蛋白表达水平。与对照组比较，人参皂苷Rg3组胰腺癌裸鼠皮下移植瘤质量显著降低（＜0.05），微血管密度显著降低（＜0.05），VE-cadherin、EphA2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低（＜0.05）。人参皂苷Rg3可能通过调控VE-cadherin、EphA2 mRNA和蛋白表达，从而抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成。

人参皂苷Rg3；胰腺癌；新生血管；血管内皮钙黏素；络氨酸激酶受体A2

胰腺癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，发病率位居恶性肿瘤第7位，病死率位居第6位[1]。胰腺癌恶性程度高，由于其生物学特性，患者早期无特异性临床症状，病情进展迅速，部分患者就诊时已发展为晚期阶段，临床治疗效果不佳[1-2]。目前临床以手术、靶向、免疫等治疗及化疗为主[3]。研究发现，肿瘤新生血管的形成与机体血液循环有关，可促进肿瘤的生长、转移与侵袭[4-5]。因此，基于肿瘤新生血管的研究是开发抗肿瘤药物的新方向。人参具有显著的抗肿瘤作用，人参皂苷是其主要活性成分。人参皂苷Rg3具有抑制新生血管形成的作用[6-8]，临床常将以人参皂苷Rg3为主要活性成分的参一胶囊用于多种肿瘤的辅助治疗。本研究通过建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，考察人参皂苷Rg3对裸鼠肿瘤新生血管的影响，并探讨人参皂苷Rg3抑制胰腺癌新生血管形成的作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性BALB/C裸鼠，4～6周龄，体质量18～22 g，购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号SYXK（浙）2015-0009。动物饲养于温州医科大学SPF级屏障系统的洁净层流架内，温度（25±1）℃、相对湿度40%～60%，自由进食饮水。动物实验经温州医科大学实验动物中心伦理委员会批准（批准号wydw2019-0012）。

1.2 细胞

胰腺癌SW-1990细胞株购自美国ATCC。

1.3 药品与试剂

人参皂苷Rg3（质量分数≥98%）购自上海博蕴生物科技有限公司；血管内皮钙黏素（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）抗体购自美国abgent公司；络氨酸激酶受体A2（erythropoietin- producing hepatocellular receptor A2，EphA2）抗体购自美国R&D公司；CD31抗体购自美国Santa Cruz公司；山羊抗鼠生物素标记的抗体购自美国Earthox公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；荧光定量PCR试剂盒购自瑞士Roche公司；ECL化学发光法检测试剂盒购自美国Thermo公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；免疫组化二步法试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.4 仪器

Elx800型全自动酶标仪（奥地利KIALAB公司）；电泳仪、电泳槽（美国Bio-Rad公司）；3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；TS100倒置显微镜、E4500型照相机（日本Nikon公司）；Image-proplus 6.0免疫组化彩色图像（美国Media Cybemetics公司）；GS-15R低温高速离心机（美国Beckman公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

SW-1990细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养，细胞生长至70%～80%时进行传代。

2.2 动物模型建立、分组与给药

取处于对数生长期的SW-1990细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为3×106/L，于裸鼠背侧近右后肢处sc 100 μL细胞悬浮液，1周后，按照文献方法[9]，将荷瘤裸鼠随机分为对照组及人参皂苷Rg3低、高剂量（10、20 mg/kg）组，每组8只。人参皂苷Rg3溶于生理盐水配制成质量浓度为l mg/mL的溶液，给药组ip人参皂苷Rg3，对照组ip 0.9%氯化钠溶液，每2天1次，连续4周。给药结束3 d后，裸鼠脱颈椎处死，取瘤组织，称定瘤质量并计算人参皂苷Rg3的抑瘤率。

抑瘤率＝(对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量

2.3 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影响

各组瘤组织于4%多聚甲醛中固定48 h，纵行切取瘤组织，于自动组织处理机处理并切片，采用免疫组化法检测血管标志物CD31表达情况。根据Weidner计数方法，镜下观察微血管呈棕色的单个或成簇细胞，在100×光镜下寻找病灶微血管密度高的区域，在400×光镜下随机计算5个视野下的微血管数，计算其平均值，作为肿瘤微血管密度。

2.4 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表达的影响

按照Trizol试剂盒说明书提取瘤组织总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-AAGCGTGAGTCGCAA-3’、下游引物5’-TCTC- CAGGTTTTCGC-3’；上游引物5’-GAGGGC- GTCATCTCCAAATA-3’、下游引物5’-TCAGACAC- CTTGCAGACCAG-3’；上游引物5’-GAGT- CAACGGATTTGGTCGT-3’、下游引物5’-TTGATT- TTGGAGGGATCTCG-3’。

2.5 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表达的影响

取100 mg瘤组织，加入0.8 mL裂解液研磨，于冰上孵育30 min，40 ℃、12 000 r/min离心5 min；超声裂解3次，40 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清，采用BCA定量试剂盒测定蛋白质量浓度。蛋白样本经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入VE-cadherin、EphA2抗体，于4 ℃孵育过夜；TBS洗涤3次，加入山羊抗鼠生物素标记的抗体，室温孵育2 h；TBS洗涤3次，加入ECL化学发光液曝光显像，采用Alpha Ease FC 4.0软件分析结果。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤的影响

如表1所示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤质量显著降低（＜0.05），呈剂量相关性。

3.2 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影响

如图1和表2所示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组皮下移植瘤微血管密度显著降低（＜0.05），呈剂量相关性。

表1 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤的影响()

与对照组比较：*＜0.05，下表同

*< 0.05control group, same as below tables

图1 人参皂苷Rg3对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影响(×400)

表2 人参皂苷Rg3对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影响()

3.3 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表达的影响

如表3所示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤中和mRNA水平显著降低（＜0.05），呈剂量相关性。

3.4 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表达的影响

如图2和表4所示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤中VE-cadherin和EphA2蛋白表达水平显著降低（＜0.05），呈剂量相关性。

表3 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2 mRNA表达的影响()

图2 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表达的影响

4 讨论

肿瘤转移与肿瘤的微血管生成密切相关，微血管生成可作为肿瘤转移、复发和预后的重要指标[10]。本研究结果显示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤质量降低，微血管生成减少，表明人参皂苷Rg3通过抑制荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管生成，从而抑制皮下移植瘤生长。局部的毛细血管基底膜降解，血管内皮细胞增殖并迁移，内皮细胞形成新的毛细血管。VE-cadherin仅在内皮细胞表达，是内皮细胞特异性标志物，在维持血管内皮细胞极性和完整性中发挥重要作用。VE-cadherin的表达与肿瘤的发生密切相关，VE-cadherin可促进内皮细胞向肿瘤病灶的黏附、迁移，促进病灶内新生血管的形成[11]，且与肿瘤体积呈正相关[12-13]。EphA2是Eph受体络氨酸激酶家族成员之一，在多种恶性肿瘤或细胞株中高表达[14]。EphA2与其配体Ephrin A1结合后，激活下游胞质底物蛋白，在肿瘤新生血管形成中发挥重要作用[15]。阻断EphA2信号转导或阻断EphA受体酪氨酸激酶可抑制肿瘤血管生成[14]。研究发现，VE-cadherin可重新分布EphA2的配体，使EphA2与EphrinA1结合[16]。本研究结果显示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表达水平均显著降低，提示人参皂苷Rg3可抑制血管内皮细胞增殖、迁移，下调VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表达，阻止EphA2与其配体结合，阻断EphA2信号转导。

表4 人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表达的影响()

本研究表明，人参皂苷Rg3可抑制VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表达，抑制瘤组织血管生成，从而提高荷瘤裸鼠生存质量。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effect of ginsenoside Rg3on neovascularization of subcutaneous transplantation tumor of pancreatic cancer in nude mice

GUO Jing-qiang1, LIN Sheng-zhang2

1. Fifth Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Lishui Central Hospital, Lishui 323000, China 2. Shulan Hangzhou Hospital Affiliated to Zhejiang Shuren University, Shulan International Medical College, Hangzhou 310004, China

To explore the effect of ginsenoside Rg3on the angiogenesis of subcutaneously transplanted tumor of pancreatic cancer in nude mice.Back of nude mice near the right hind limb were sc pancreatic cancer SW-1900 cells to establish a pancreatic cancer subcutaneous transplantation tumor model. Tumor-bearing nude mice were randomly divided into control group, low- and high-dose ginsenoside Rg3(10, 20 mg/kg) groups. Rats in administration group were ip ginsenoside Rg3and rats in control group were ip 0.9% sodium chloride solution, once every 2 d for four consecutive weeks. Three days after administration, nude mice were sacrificed by cervical vertebrae, and tumor tissues were collected. Immunohistochemical method was used to detect the expression of endothelial cell marker CD31 in the tumor tissues of nude mice, and the microvessel density was calculated. qRT-PCR and Western blotting were used to detect vascular endothelial cadherin (VE-cadherin), erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2 (EphA2) mRNA and protein expression levels.Compared with the control group, the weight of subcutaneously transplanted pancreatic cancer nude mice in ginsenoside Rg3group were significantly reduced (< 0.05); Microvessel density were significantly reduced (< 0.05), mRNA and protein expression levels of VE-cadherin and EphA2 were significantly reduced (< 0.05).Ginsenoside Rg3can regulate the expression of VE-cadherin and EphA2 mRNA and protein expression, thereby inhibiting the angiogenesis of subcutaneously transplanted pancreatic cancer in nude mice.

ginsenoside Rg3; pancreatic cancer; angiogenesis; vascular endothelial cadherin; erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2

R285.5

A

0253 - 2670(2021)06 - 1668 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.015

2020-10-25

郭敬强，男，硕士研究生，主治医师，从事肝胆胰临床研究。

林胜璋，男，医学博士，主任医师，教授，博士研究生导师，从事肝胆胰肿瘤治疗基础与临床研究。E-mail: wzfz1sz@163.com

[责任编辑 李亚楠]