基于NF-κB通路探讨杜仲皮、叶醇提物对胶原诱导型关节炎大鼠炎症性骨破坏的影响

张 妍，王健英，陈晓云，张 磊，袁 颖*

• 药理与临床 •

基于NF-κB通路探讨杜仲皮、叶醇提物对胶原诱导型关节炎大鼠炎症性骨破坏的影响

张 妍1，王健英2，陈晓云3，张 磊2，袁 颖1*

1. 上海中医药大学中药学院，上海 201203 2. 上海中医药大学协同创新中心，上海 201203 3. 上海中医药大学附属龙华医院类风湿科，上海 200032

研究杜仲皮、叶醇提物对胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠骨破坏的治疗作用及机制。随机选取6只雌性Wistar大鼠作为对照组，其余大鼠于背部多点及尾根部sc 0.1 mL牛II型胶原乳剂建立CIA模型，第14天将CIA大鼠随机分为模型组，杜仲皮醇提物低、高剂量（2、4 g/kg）组，杜仲叶醇提物低、高剂量（2、4 g/kg）组及甲氨蝶呤（1 mg/kg）组，各给药组ig相应药物，1次/d，连续4周。观察各组大鼠足肿胀情况；采用苏木精-伊红（HE）染色法观察各组大鼠踝关节病理变化；采用ELISA法检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；采用qRT-PCR法检测各组大鼠脾脏中炎性因子如、TNF受体相关因子-6（TNF receptor-associated factor-6，）、、、mRNA表达，膝关节组织中破骨细胞标志物如抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，）、活化T细胞的核因子c1（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，）、组织蛋白酶K（cathepsin K，）、原癌基因、核转录因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand，）mRNA表达，膝关节组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，）、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，）mRNA表达及成骨细胞标志物如金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor 1of metalloproteinases，）、骨钙素（osteocalcin，、骨保护素（osteoprotegerin，）mRNA表达；采用Western blotting法检测各组大鼠膝关节组织中磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶α/β（phosphorylated inhibitor of NF-κB kinase α/β，p-Iκκα/β）、磷酸化NF-κB抑制蛋白α（phosphorylated inhibitor α of NF-κB，p-IκBα）、磷酸化p65（p-p65）蛋白表达情况。与模型组比较，杜仲皮、叶醇提物可显著降低CIA大鼠足肿胀度（＜0.05、0.01）；改善踝关节组织病理；显著降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6水平（＜0.01）；显著降低CIA大鼠脾脏中、、、mRNA表达水平（＜0.05、0.01），显著降低CIA大鼠膝关节组织中、、、、、、mRNA表达水平（＜0.01），显著升高CIA大鼠膝关节组织中、、mRNA表达水平（＜0.05、0.01），显著降低CIA大鼠膝关节组织中p-Iκκα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表达水平（＜0.01）。杜仲皮、叶醇提物可以减轻CIA大鼠关节炎症，抑制促血管生成因子的表达，延缓关节内软骨与骨的破坏，其机制与调控NF-κB通路相关的炎症性骨代谢有关。

类风湿关节炎；杜仲皮、叶醇提物；胶原诱导型关节炎；大鼠；炎症；骨破坏

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性多关节炎症和骨质破坏为主的自身免疫疾病，其主要病理特征为滑膜炎性细胞增生、软骨和骨破坏、关节畸形等。目前治疗RA的药物主要针对关节炎症，研究发现，RA后期，即使滑膜炎症已经得到控制，但骨质的破坏仍可造成关节不可逆损伤[1]。核转录因子-κB（nuclear factor- κB，NF-κB）位于细胞质中，与NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）结合为非活性复合物，炎性状态下IκB蛋白降解，NF-κB被释放并转移到细胞核，调控炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）转录，激活多个炎症信号。关节内的巨噬细胞可分泌大量炎性细胞因子，激活NF-κB通路，导致大量炎性细胞浸润，加剧软骨损伤[2]。

中医常选用具有祛风湿、强筋骨、活血化瘀等功效的药物治疗RA，既能抗炎、镇痛，也能抑制自身免疫应答的发生并调节全身免疫系统。杜仲具有补肝肾、强筋骨的功效，常用于治疗肝肾亏虚、腰膝酸痛。杜仲的活性成分具有降血压、提高免疫功能、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、利尿等作用[3-5]。课题组前期研究发现，杜仲皮醇提物体外可抑制人RA滑膜细胞的增殖，促进其凋亡；体内可降低胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型足肿胀及关节炎评分、改善滑膜炎症浸润、减轻血管翳形成[6]。杜仲皮作为杜仲的传统入药部位，药源日趋紧缺。本研究探究杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠骨破坏的治疗作用及机制，为杜仲皮、叶等药用部位应用于RA的治疗提供依据。

1 材料

1.1 动物

雌性Wistar大鼠42只，体质量（120±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2016-0011。动物实验经上海中医药大学实验动物福利和动物实验伦理委员会批准（批准号PZSHUTCM18122823）。

1.2 药材

杜仲皮、叶（批号分别为180915、20181116）购于上海康桥中药饮片公司，经上海中医药大学吴靳荣教授鉴定为杜仲科植物杜仲Oliv.的干燥树皮及叶。

1.3 药品与试剂

甲氨蝶呤（2.5 mg/片，批号036170604）购自上海上药信谊药厂有限公司；Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂购自美国Chondrex公司；TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；RNA提取试剂盒、4×Reverse Transcription Master Mix、2×SYBR Green qPCR Master Mix购自美国EZBioscience公司；引物购自上海生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、牛血清白蛋白购自大连美仑生物技术有限公司；RIPA裂解液购自美国Sigma公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自瑞士Roche公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、蛋白上样缓冲液、三色预染蛋白Marker、超敏发光液购自上海雅酶生物科技有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体购自武汉ABclonal公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、磷酸化p65（p-p65）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶α/β（phosphorylated inhibitor of NF-κB kinase α/β，p-Iκκα/β）抗体购自美国CST公司。

1.4 仪器

低速台式离心机（德国Eppeddorf公司）；正置显微镜（日本Olympus公司）；多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；YLS-7A足趾容积测量仪（济南益延科技发展有限公司）；RM2265全自动轮转式石蜡切片机（德国Leica公司）；实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；电泳仪、电泳槽、转印槽（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 杜仲皮、叶醇提物的制备

分别精确称取200 g干燥杜仲皮、叶粉末，加入70%乙醇，加热回流提取，真空干燥。杜仲皮、叶醇提物临用前分别以蒸馏水配制成质量浓度为0.5、1.0 g/mL（以生药量计）的溶液，分别用作杜仲皮、叶醇提物低、高剂量组[6-9]。

2.2 CIA大鼠模型制备、分组与给药

牛II型胶原蛋白溶于0.1 mol/L醋酸，与等体积完全弗氏佐剂乳化，制成稳定的乳剂（10 mg/mL）。随机选取6只大鼠作为对照组，其余大鼠于背部多点及尾根部sc 0.1 mL乳剂，对照组大鼠于同部位sc等体积生理盐水，记为第0天；第7天，大鼠尾根部sc 0.1 mL乳剂，加强免疫。第14天大鼠CIA模型成功建立，按照文献报道方法[10]，将CIA大鼠随机分为模型组，杜仲皮醇提物低、高剂量（2、4 g/kg，EB-2、EB-4）组，杜仲叶醇提物低、高剂量（2、4 g/kg，EL-2、EL-4）组及甲氨蝶呤（1 mg/kg）组，每组6只。各给药组大鼠ig相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续4周。

2.3 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠足容积和关节炎评分的影响

每7天用足趾容积测量仪测量大鼠足容积，并进行关节炎评分。关节炎评分标准：0分为无肿胀、红肿；1分为跗骨或踝关节出现红肿；2分为从脚踝到跗骨出现肿胀和发红；3分为从脚踝到跖骨关节出现红肿；4分为脚踝、跗骨和跖骨周围红肿[11]。

2.4 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠血清炎症因子水平的影响

给药结束后，乌拉坦麻醉大鼠，采用腹主动脉取血，按照试剂盒说明书检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平。

2.5 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠踝关节病理变化的影响

大鼠脱颈椎处死，取各组大鼠踝关节，于4%多聚甲醛中固定24 h，10%乙二胺四乙酸脱钙、石蜡包埋后切片（厚4 mm）；苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察各组大鼠踝关节的滑膜炎症、血管醫形成及骨破坏情况并评分。评分标准：0分为无炎性细胞浸润、无血管翳形成、无骨破坏；1分为炎性细胞浸润或轻微水肿、少量血管翳形成、骨轻度破坏；2分为炎性细胞中等浸润、大量血管翳形成、骨中度破坏；3分为炎性细胞严重浸润、关节腔狭窄；4分为血管翳形成、骨重度破坏[9]。

2.6 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠脾脏及膝关节中炎症因子和骨代谢因子mRNA表达的影响

取各组大鼠脾脏及膝关节，按照试剂盒说明书提取RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析，检测大鼠脾脏中、、、及膝关节中抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，）、TNF受体相关因子-6（TNF receptor-associated factor-6，）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，）、缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，、活化T细胞的核因子c1（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，）、组织蛋白酶K（cathepsin K，）、原癌基因、核转录因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand，）、金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor 1 of metalloproteinases，）、骨钙素（osteocalcin，、骨保护素（osteoprotegerin，）mRNA表达情况。qRT-PCR程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40个循环，72 ℃延伸90 s。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠NF-κB通路相关蛋白表达

取20 mg各组大鼠膝关节组织，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂）于冰上研磨，提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭，分别加入p-Iκκα/β、p-IκBα、p-p65抗体（1∶1000），于4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶5000），于室温孵育2 h，加入超敏发光液，采用蛋白凝胶电泳成像仪曝光，Image软件分析蛋白条带的灰度值。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠足容积和关节炎评分的影响

如图1-A所示，与对照组比较，自第14天造模大鼠足容积显著升高（＜0.01），踝关节红肿明显、变形严重，表明CIA模型制备成功；与模型组比较，自第28天，各给药组大鼠足容积显著降低（＜0.01），关节肿胀程度均减轻。如图1-B所示，与对照组比较，自第14天造模大鼠关节炎评分显著升高（＜0.01）；与模型组比较，自第21天，各给药组大鼠关节炎评分显著降低（＜0.05、0.01）。

与对照组比较：#P＜0.05 ## P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下图同

3.2 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠踝关节病理变化的影响

如图2所示，对照组大鼠关节组织未见明显病理性改变；模型组大鼠关节软骨变性坏死，纤维组织增生，关节腔内大量炎性细胞浸润，部分骨及骨小梁坏死；EB-2组大鼠关节软骨部分变性坏死，血管翳形成，纤维组织、滑膜增生，炎性细胞浸润；EB-4组大鼠关节组织少量关节滑膜变性坏死，血管翳形成，滑膜增生；EL-2组大鼠关节滑膜变性坏死，纤维组织增生，关节腔内大量炎性细胞浸润，纤维组织增生，滑膜增生，部分骨及骨小梁坏死；EL-4组大鼠关节软骨部分变性坏死，血管翳形成，滑膜增生，炎性细胞浸润；甲氨蝶呤组关节组织关节腔内少量炎性细胞浸润，少量滑膜增生。如图3所示，与模型组比较，各给药组病理评分均显著降低（＜0.01）。

白色箭头表示滑膜增生及血管翳；黑色箭头表示软骨侵蚀

图3 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠踝关节病理变化的影响 ()

3.3 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠血清炎症因子水平的影响

如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平显著升高（＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平均明显降低（＜0.01），表明杜仲皮、叶醇提物可以降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6等炎症因子水平，对炎症具有一定的抑制作用。

3.4 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠脾脏中炎症因子mRNA表达的影响

如图5所示，与对照组比较，模型组大鼠脾脏中、、、mRNA表达水平显著升高（＜0.05、0.01）；与模型组比较，除EL-2组大鼠脾脏中仅、、mRNA表达水平显著降低（＜0.01），其余给药组大鼠脾脏中、、、mRNA表达水平均显著降低（＜0.01）。

3.5 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠膝关节中骨代谢因子mRNA表达的影响

如图6所示，与对照组比较，模型组大鼠膝关节组织中血管新生相关因子如、及破骨细胞标志物如、、、、mRNA表达水平均显著升高（＜0.01），成骨标志物如、mRNA表达水平均显著降低（＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠膝关节组织中血管新生相关因子如、及破骨细胞标志物如、、、、mRNA表达水平均显著降低（＜0.01），EB-2组大鼠膝关节组织中、mRNA表达水平显著升高（＜0.01），EB-4组大鼠膝关节组织中、、mRNA表达水平显著升高（＜0.05、0.01），EL-2组大鼠膝关节组织中mRNA表达水平显著升高（＜0.01），EL-4组大鼠膝关节组织中、、mRNA表达水平均显著升高（＜0.05、0.01）。

图4 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠血清中TNF-α (A) 和IL-6 (B) 水平的影响()

图5 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠脾脏中TNF-α (A)、IL-1β (B)、TRAF-6 (C) 和IL-17 (D) mRNA表达的影响 ()

3.6 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠膝关节组织NF-κB通路相关蛋白表达的影响

如图7、8所示，与对照组比较，模型组大鼠膝关节组织NF-κB通路中p-Iκκα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表达水平均显著升高（＜0.05、0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠膝关节组织中p-IκBα、p-p65蛋白表达水平均显著降低（＜0.01），EB-4、EL-4组大鼠膝关节组织中p-Iκκα/β蛋白表达水平显著降低（＜0.01）。

4 讨论

RA是一种以慢性多关节炎症和骨破坏为主的自身免疫疾病，中医学认为RA属于“痹病”范畴，风寒湿邪导致经络闭阻为标，肝肾亏虚为本。杜仲具有补肝肾、强筋骨的功效，在增强免疫、降血压、抗骨质疏松、抗炎和抗衰老等方面有一定的作用[3]。

图6 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠膝关节中VEGF (A)、HIF-1 (B)、NFATc1 (C)、TRAP (D)、c-Fos (E)、CTSK (F)、RANKL (G)、TIMP1 (H)、OCN (I) 和OPG (J) mRNA表达的影响()

图7 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠膝关节中NF-κB通路相关蛋白表达的影响

图8 杜仲皮、叶醇提物对CIA大鼠膝关节中NF-κB通路相关蛋白表达的影响()

杜仲叶与杜仲皮具有相似的化学成分和临床功效。研究表明，杜仲叶具有抗骨质疏松、抑菌和抗氧化的药理作用[12]；杜仲叶总提取物可以改善骨质疏松（osteoporosis，OP）模型动物骨代谢，增加骨质疏松模型动物的骨密度，加强骨稳定、减少骨破坏，可有效防治骨质疏松症[13]；杜仲叶提取物/磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）复合载体具有促进成骨细胞增殖、生长、黏附的作用[14]。课题组前期研究发现，杜仲皮对CIA模型大鼠具有良好的治疗作用，但杜仲叶与杜仲皮药理作用的一致性尚不明确。

本研究结果显示，模型组大鼠关节红肿、踝关节畸形，与RA临床表现相似；杜仲皮、叶明显减轻CIA大鼠的关节肿胀程度，减轻关节软骨部分坏死，减少血管翳形成，抑制炎细胞浸润、纤维组织及滑膜增生，表明杜仲皮与杜仲叶可有效抑制CIA大鼠模型关节炎症反应，改善关节病理特征。

TNF-α、IL-1β、IL-6由活化的巨噬细胞产生，在RA的发生、发展中起重要作用。TNF-α、IL-1β可激活NF-κB，从而激活内皮细胞，促进血管新生因子生成，为炎症细胞提供营养和氧，促进其向炎症组织浸润。IL-6可刺激中性粒细胞迁移，促进破骨细胞成熟，促进VEGF生成，诱导炎性细胞浸润，从而导致血管炎、滑膜炎和关节破坏[15]。TNF和IL-6受体阻断剂可有效延缓RA骨侵蚀[16]。本研究结果显示，杜仲皮、叶醇提物可显著降低CIA大鼠血清中TNF-α、IL-6水平及脾脏中、、、mRNA表达水平及膝关节中、mRNA表达水平，表明杜仲的抗炎作用可能与抑制促炎因子的产生及血管新生有关。

炎性状态下，IκB蛋白降解，NF-κB被释放并转移到细胞核，炎症因子的增加激活Iκκ、IκB、p65使之磷酸化，从而调节一系列靶基因的转录活性[2]。NF-κB信号通路与RA血管新生有关，在破骨细胞中，NF-κB介导RANKL诱导的VEGF表达[17]。NF-κB的激活增加了HIF-1α启动子的活性，从而增加了HIF-1α表达[18]。破骨细胞是来源于单核细胞系的巨大多核细胞，是唯一能够在体内吸收骨的细胞，可通过与细胞外基质蛋白的相互作用来吸收骨基质。RA中，RANKL激活NF-κB信号，破骨细胞合成的基质酶如CTSK、TRAP等可降解骨基质，加剧骨侵蚀[19]。本研究结果显示，杜仲皮、叶醇提物可显著降低CIA大鼠膝关节中p-Iκκα/β、p-IκBα、p-p65蛋白表达水平，抑制NF-κB信号通路的激活；杜仲皮、叶醇提物可显著降低CIA大鼠膝关节中、、、、mRNA表达水平，升高成骨细胞标志物、mRNA表达水平，表明杜仲皮、叶醇提物可抑制破骨细胞成熟及骨基质降解，对骨代谢有一定的调节作用，杜仲皮、叶醇提物可能通过抑制NF-κB信号通路来改善CIA大鼠模型的炎症性骨破坏。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）参与组织的重塑、修复及血管生成等，受TIMP调节，骨关节炎、RA等疾病发生时，MMPs蛋白表达升高，与TIMP的平衡被打破[20]。本研究结果显示，模型组大鼠膝关节中mRNA表达水平降低，杜仲皮、叶醇提物可上调mRNA表达水平，表明杜仲皮、叶醇提物对关节炎有一定的改善作用，课题组后续将进一步研究杜仲皮、叶醇提物对MMPs的影响。

综上所述，杜仲皮、叶醇提物可以减轻CIA大鼠关节炎症，抑制促血管生成因子的表达，延缓关节内软骨与骨的破坏，其机制与调控NF-κB通路相关的炎症性骨代谢有关。在改善炎症性骨破坏方面，杜仲皮与杜仲叶有着相似的作用，杜仲叶在一定程度上可替代杜仲皮用于治疗RA。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] Brodszky V, Bíró A, Szekanecz Z,. Determinants of biological drug survival in rheumatoid arthritis: Evidence from a Hungarian rheumatology center over 8 years of retrospective data [J]., 2017, 9: 139-147.

[2] Duan W, Li H. Combination of NF-κB targeted siRNA and methotrexate in a hybrid nanocarrier towards the effective treatment in rheumatoid arthritis [J]., 2018, 16(1): 58.

[3] He X R, Wang J H, Li M X,.Oliv.: Ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine [J]., 2014, 151(1): 78-92.

[4] 李莉莉, 马宁宁, 范姗姗, 等. 杜仲不同提取物对帕金森病小鼠的治疗作用及谱效关系研究[J]. 中草药, 2019, 50(6): 1400-1406.

[5] Li Z Y, Gu J, Yan J,. Hypertensive cardiac remodeling effects of lignan extracts fromOliv. bark: A famous traditional Chinese medicine [J]., 2013, 41(4): 801-815.

[6] Wang J Y, Yuan Y, Chen X J,. Extract fromOliv. ameliorates arthritis via regulation of inflammation, synoviocyte proliferation and osteoclastogenesisand[J]., 2016, 194: 609-616.

[7] 钟淑娟, 杨欣, 李静, 等. 杜仲不同部位总黄酮含量及抗氧化活性研究 [J]. 中国药房, 2017, 28(13): 1787-1790.

[8] 曹洪斌, 申明金, 任铜彦, 等. 杜仲总黄酮提取方法的研究进展 [J]. 陕西农业科学, 2017, 63(8): 62-65.

[9] Wang J Y, Chen X J, Zhang L,. Comparative studies of different extracts fromOliv. against rheumatoid arthritis in CIA rats [J]., 2018, 2018: 7379893.

[10] Zhai W J, Ma Z H, Wang W J,. Paeoniflorin inhibits Rho kinase activation in joint synovial tissues of rats with collagen-induced rheumatoid arthritis [J]., 2018, 106: 255-259.

[11] Kawamura H, Kawamura T, Kanda Y,. Extracellular ATP-stimulated macrophages produce macrophage inflammatory protein-2 which is important for neutrophil migration [J]., 2012, 136(4): 448-458.

[12] 屠万倩, 李宁, 张留记, 等. 不同加工方式生产的杜仲叶中8种化学成分的含量及抗氧化活性研究 [J]. 中国新药杂志, 2020, 29(16): 1863-1867.

[13] 饶华, 徐贤柱, 王曼莹. 杜仲叶总提取物治疗去势大鼠骨质疏松症的实验研究 [J]. 江西医药, 2014, 49(2): 100-102.

[14] 林军, 李幼琴, 李万红, 等. 杜仲叶提取物/CPC复合载体对大鼠成骨细胞作用的实验研究 [J]. 浙江大学学报: 医学版, 2008, 37(1): 78-82.

[15] Pirmardvand Chegini S, Varshosaz J, Taymouri S. Recent approaches for targeted drug delivery in rheumatoid arthritis diagnosis and treatment [J]., 2018, 46(2): 502-514.

[16] Schett G, Stach C, Zwerina J,. How antirheumatic drugs protect joints from damage in rheumatoid arthritis [J]., 2008, 58(10): 2936-2948.

[17] Fearon U, Canavan M, Biniecka M,. Hypoxia, mitochondrial dysfunction and synovial invasiveness in rheumatoid arthritis [J]., 2016, 12(7): 385-397.

[18] Park S Y, Lee S W, Kim H Y,. HMGB1 induces angiogenesis in rheumatoid arthritis via HIF-1α activation [J]., 2015, 45(4): 1216-1227.

[19] Schett G, Gravallese E. Bone erosion in rheumatoid arthritis: Mechanisms, diagnosis and treatment [J]., 2012, 8(11): 656-664.

[20] Li X, Wu J F. Recent developments in patent anti-cancer agents targeting the matrix metalloproteinases (MMPs) [J]., 2010, 5(2): 109-141.

Effects of ethanol extracts of barks and leaves fromon inflammatory bone destruction in collagen-induced arthritis rats based on NF-κB pathway

ZHANG Yan1, WANG Jian-ying2, CHEN Xiao-yun3, ZHANG Lei2, YUAN Ying1

1. School of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Shanghai Innovation Center of TCM Health Service, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 3. Shanghai Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China

To study the therapeutic effect and mechanism of alcohol extract of barks and leaves from Duzhong ()on bone destruction of collagen-induced arthritis (CIA) rats.Six female Wistar rats were randomly selected as control group, the rest of rats were sc 0.1 mL bovine type Ⅱ collagen emulsion at multiple points on back and tail to establish CIA model. On 14th day, CIA rats were randomly divided into model group, alcohol extract of barks fromlow- and high-dose (2 and 4 g/kg) groups, alcohol extract of leaves fromlow- and high-dose (2 and 4 g/kg) groups, and methotrexate (1 mg/kg) group, rats were ig corresponding drugs, once a day for 4 weeks. Foot swelling situation of each group was observed. Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the pathological changes of ankle joint in each group of rats. Levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in serum were detected by ELISA. qRT-PCR was used to detect mRNA levels of inflammatory factors such as, TNF receptor related factor-6 (),,, andin spleen, osteoclast markers such as tartrate resistant acid phosphatase (), nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1 (), cathepsin K (), proto-oncogene, and receptor activator of NF-κB ligand () mRNA expressions, vascular endothelial growth factor (), and hypoxia inducible factor-1 () mRNA expressions, and osteoblast markers such as tissue inhibitor 1 of metalloproteinases (), osteocalcin () and osteoprotegerin () mRNA expressions in knee joints; Western blotting was used to detect expressions of phosphorylated inhibitory of NF-κB kinase α/β (p-Iκκα/β), phosphorylation inhibitor α of NF-κB (p-IκBα), phosphorylated p65 (p-p65) in knee joints.Compared with model group, swelling of feet was significantly reduced (< 0.05, 0.01), pathology of ankle joint was improved, levels of TNF-α and IL-6 in serum were significantly reduced (< 0.01),,,,mRNA levels in spleen were significantly reduced (< 0.05, 0.01),,,,,,,mRNA levels in knee joints were significantly reduced (< 0.01),,,mRNA levels in knee joints were significantly increased (< 0.05, 0.01), expressions of p-Iκκα/β, p-IκBα, and p-p65 in knee joints were significantly reduced (< 0.01) in alcohol extract of barks and leaves fromgroups.Barks and leaves fromcan relieve joint inflammation in CIA rats, inhibit expressions of pro-angiogenic factors, and delay the destruction of cartilage and bone in the joints, of which mechanism is related to the regulation of inflammatory bone metabolism related to NF-κB pathway.

rheumatoid arthritis; alcohol extract of barks and leaves fromOliv.; collagen-induced rheumatoid arthritis; rats; inflammation; bone destruction

R285.5

A

0253 - 2670(2021)06 - 1645 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.012

2020-11-06

国家自然科学基金资助项目（81773922）；上海自然科学基金资助项目（19ZR1452000）

张 妍（1996—），女，硕士研究生，研究方向为中药及复方药效作用机制研究。E-mail: ZY180629@163.com

袁 颖，女，博士，硕士生导师，研究方向为中药及复方药效作用机制研究。Tel: 18621174662 E-mail: yyin921@163.com

[责任编辑 李亚楠]