复发性流产者绒毛组织中miR-150、miR-155表达及与血管生成因子关系

曾 静 王 璟 付 琼

四川省成都市第二人民医院(610017)

复发性流产(RSA)早期发生多由于染色体异常、内分泌异常、免疫功能异常、甲状腺功能低下等导致，晚期发生多因子宫解剖异常、免疫异常、血栓前状态等[1-2]。研究表明[3]，妊早期胚胎发育于相对缺氧环境，绒毛血管发育及滋养细胞浸润能力与胚胎氧分压相关密切，机体正常妊娠依赖于绒毛血管增生与滋养细胞增殖浸润。微小核糖核酸(miRNA)参与基因表达与细胞分裂、增殖、凋亡，在器官发育、免疫应答中起重要作用[4]。基于此，本研究探究RSA患者绒毛组织中miR-150、miR-155表达及与血管生成指标的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年3月-2020年6月本院收治的RSA患者60例(RSA组)，同期人工流产终止妊娠的早孕孕妇60例(对照组)。纳入标准：①经病理诊断确诊为RSA，均连续经历≥3次自然流产；②外周染色体核型正常；③生殖道结构正常；④临床资料完整。排除标准：①对照组中出现胚胎发育异常、阴道流血、腹痛等流产征兆；②对照组B超检查、绒毛膜促性腺激素水平异常；③合并肝肾障碍及其他恶性肿瘤；④内分泌、免疫疾病及生殖感染。本研究经本院伦理委员会审批。患者均签署知情同意书。

1.2 检测方法

荧光定量转录PCR(北京普赞生物技术有限公司)、引物合成(汉恒生物工程(上海)有限公司)、抗体供自普健生物(武汉)科技有限公司、试剂盒供自默克化工技术(上海)有限公司。引物序列见表1。

表1 PCR检测相关引物序列

收集两组术后绒毛组织生理盐水冲洗，将标本分成两份，一份于10%甲醛中固定、脱水、石蜡包埋切片，4℃保存；另一份术后30min内置入液氮冷冻，-80℃保存。①Trizol一步法提取总RNA，测定浓度与纯度，取适量RNA行PCR，余RNA于-80℃保存。cDNA逆转录合成：根据逆转录试剂盒说明书操作，于25μl 反应体系中掺入2μl RNA行DEPC处理，70℃孵育5min，42℃经60min合成。PCR扩增：于2.0ml离心管中按顺序加入dd H2O(17.25μl)、cDNA(2.0μl)、PCRbuffer(2.50μl)、MgCl2(1.50μl)、dNTPmix(2.50μl)、上游引物(0.50μl)、下游引物(0.50μl)及TaqDNA 聚合酶(0.25μl)，混匀离心。预变性(94℃ 2min)、变形(94℃30s)、退火(1min)、延伸(72℃ 2min)、40个循环。再经延伸(72℃ 3min)，分析结果，4℃增产物保存。电泳验证，溴化乙锭染色，320nm紫外投射仪摄影，对照DNA marker进行验证。PCR反应后计算Bax、Bad、Fas、Fasl、Bcl-2、Bcl-xl以及miR-150、miR-155表达量。免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子-1(HIF-1α)、可溶性血管内皮生长因子受体(sFlt-1)表达量。一抗为鼠抗人VEGF、HIF-1α抗体，根据免疫组化二步法染色标准，以磷酸盐缓冲液作为阴性对照，观察VEGF、HIF-1α、sFlt-1的分布表达。②蛋白含量检测：取适量绒毛组织，抽提蛋白后通过BCA试剂盒进行定量检测，计算蛋白总量后按泳道进行80μg总蛋白/泳道进行western-blot反应，依次进行电泳，转膜，抗体孵化、显影，显示蛋白条带后定量分析，计算蛋白总量。

1.3 观察指标

阳性判断[5]：根据阳性细胞个数与5 个高倍视野计数细胞总数得出阳性细胞占比，≤5%记作0分，5%～35%记作1分，36%～65%记作2分，≥66%记作3分；染色强度无记作0分，淡黄记作1分，棕黄记作2分，棕褐记作3分。计算每片切片总分，总分0分为阴性，两项相乘，总分≤3分为阴性，>3分为阳性。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组一般情况

对照组年龄(25.6±6.6)岁(22～32岁)，孕周(6.6±1.2)周(4～9周)；RSA组年龄(26.2±6.9)岁(24～30岁)，孕周(6.7±1.5)周(4～10周)，流产3次36例，流产≥4次24例。两组年龄及孕周无差异(P>0.05)。

2.2 绒毛组织中miR-150、miR-155表达

RSA组miR-150表达(15.27±4.08 μg/ml)高于对照组(2.43±0.64 μg/ml)，miR -155(24.25±5.39 μg/ml)低于对照组(100.61±13.47 μg/ml)(t=24.083、40.768，P<0.001)；且RSA组流产≥4次组miR-150表达(23.18±5.12 μg/ml)高于3次组(10.41±3.56 μg/ml)，miR-155(17.15±2.31 μg/ml)低于3次组(53.18±6.47 μg/ml)(t=15.862、40.624，均P<0.001)。

2.3 绒毛组织中促凋亡分子表达

RSA组Bax、Bad、Fas、Fasl的mRNA和蛋白含量均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组绒毛组织中促凋亡分子表达量比较

2.4 绒毛组织中抗凋亡分子表达

RSA组Bcl-2、Bcl-xl的mRNA和蛋白含量均低于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 两组绒毛组织中抗凋亡分子表达量比较

2.5 绒毛组织中血管新生分子表达

RSA组VEGF、HIF-1α的mRNA和蛋白含量均低于对照组，sFlt-1的mRNA和蛋白含量均高于对照组(P<0.05)。见表4、图1(2487页)。

表4 两组绒毛组织中血管新生分子表达量比较

2.6 miR-150、miR-155表达与血管生成指标相关性

Spearman 相关性分析显示，Bax、Bad、Fas、Fasl、sFlt-1的mRNA含量、蛋白含量与miR-150呈正相关，与miR-155呈负相关(P<0.05)；Bcl-2、Bcl-xl、VEGF、HIF-1α的mRNA含量、蛋白含量与miR-150呈负相关，与miR-155呈正相关(P<0.05)。见表5、表6、表7。

表5 促凋亡因子与miR-150、miR-155表达的相关性

表6 抗凋亡因子与miR-150、miR-155表达的相关性

表7 血管新生分子与miR-150、miR-155表达的相关性

3 讨论

绒毛外滋养细胞与蜕膜是母胎界面重要组织，滋养细胞增殖侵袭蜕膜、绒毛新生血管发育对胚胎种植发育具有重要意义[6]。新生血管生成利于滋养细胞进入子宫内膜，贯穿妊娠全程，保障成功胚胎种植与正常发育。miRNA具有高保守性，参与细胞代谢凋亡过程。既往研究表明：miR可在妊娠期各个阶段发挥作用，如血管形成、子宫内膜蜕膜化等，与多种妊娠疾病相关，如RSA、子痫前期等[7]。在本研究中，RSA组miR-150表达高于对照组，miR-155低于对照组，且流产≥4次患者miR-150表达高于流产3次组、miR-155表达低于流产3次组，提示RSA患者绒毛组织中miR-150高表达、miR-155低表达，且流产次数越多miR-150表达越高、miR-155越低。既往研究提出：miR-150在正常生理条件下呈低表达，在RSA患者中呈高表达，参与细胞发展、机体免疫、造血过程，但与RSA发生相关机制尚无统一定论[8]。miR-155参与细胞增殖凋亡、血管新生调控，其表达异常抑制了细胞凋亡及诱导血管新生[9]。

细胞凋亡增殖是RSA发生关键，多种分子对其产生调控作用。B细胞淋巴瘤与白血病家族-2的Bax、Bad、Bcl-2、Bcl-xl可通过线粒体对细胞凋亡过程进行调节[10]。Bcl-2、Bcl-xl是抗凋亡因子，可通过抑制细胞色素C释放来抑制细胞凋亡；Bax、Bad是促凋亡因子，可通过与Bcl-2、Bcl-xl组成二聚体拮抗凋亡。Fasl是Fas配体，Fas、Fasl可通过受体与配体结合对死亡效应结构域产生刺激，导致细胞凋亡[11]。在本研究中，RSA组Bax、Bad、Fas、Fasl的mRNA和蛋白含量均高于对照组，Bcl-2、Bcl-xl的mRNA和蛋白含量均低于对照组，提示RSA患者体内促凋亡因子含量更高，细胞凋亡更严重，说明细胞凋亡参与了RSA发生过程。

VEGF具有增加血管通透性、血管细胞迁移、细胞基质变性、血管增殖作用[12]。HIF-1α是调控缺氧的转录适应因子，也是缺氧诱导血管新生的调节因素，其活性受氧浓度调节。sFlt-1可通过与VEGF结合促进血管新生。本研究中，RSA组VEGF、HIF-1α的mRNA和蛋白含量均低于对照组，sFlt-1的mRNA和蛋白含量均高于对照组，提示RSA患者存在血管新生障碍而引发再次流产。有研究表明[13-14]，早孕患者体内存在缺氧症状，通过HIF-1α高表达促进VEGF表达上升，VEGF作用血管细胞促进胎盘血管新生，维持血管通透性。

本文Spearman 相关性结果显示，Bax、Bad、Fas、Fasl、sFlt-1的mRNA含量、蛋白含量与miR-150呈正相关，与miR-155呈负相关；Bcl-2、Bcl-xl、VEGF、HIF-1α的mRNA含量、蛋白含量与miR-150呈负相关，与miR-155呈正相关。提示miR-150高表达伴随机体细胞凋亡与血管新生障碍，miR-155高表达意味着机体细胞抗凋亡与血管新生正常。分析原因可能为：miR-155、miR150靶基因为VEGF，可通过对VEGF调节参与疾病发生[15-16]。本研究存在不足之处，miR-155、miR150调节VEGF影响RSA具体机制尚不明，还需深入研究阐明，可作为临床研究方向。

综上所述，miR150在RSA患者绒毛组织中呈高表达、miR155呈低表达，miR150与血管生成呈负相关、miR155与血管生成呈正相关。