血液分离大肠埃希菌喹诺酮类抗菌药物的耐药机制研究

时培勤，余琪琪，李 锴△

1.上海交通大学附属第六人民医院南院检验科，上海 201499；2.上海市奉贤区中心医院检验科，上海 201499

大肠埃希菌是临床上引起血流感染最常见的病原菌之一，严重者可引起菌血症甚至脓毒血症。喹诺酮类抗菌药物是临床上治疗血流感染常用的抗菌药物之一，随着耐药菌株不断产生，导致该类药物在血液感染治疗中的使用受限[1]。现有的研究主要集中于尿液分离的大肠埃希菌，对血液分离的大肠埃希菌喹诺酮耐药机制目前未见系统性报道。鉴于临床血液分离大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物表现出较高水平耐药，本研究拟对上海交通大学附属第六人民医院南院血液分离的50株大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况进行分析及其耐药机制进行初步探究，以期指导临床合理用药。

1 材料与方法

1.1菌株来源 试验材料所涉及的菌株收集于上海交通大学附属第六人民医院南院，从2016-2018年老年就诊患者(60周岁以上)的血液样本中分离的大肠埃希菌共50株，其中已排除相同患者相近时间段重复分离的大肠埃希菌，以确保试验的有效性。

1.2仪器与试剂 ABI Verti型PCR仪由Applied Biosystems公司提供，Syngene·G-BOX-EF2型凝胶成像仪和Nina-drop2000c型DNA定量仪由基因公司提供，Tanon-HE-90C型水平电泳仪由上海天能公司提供，DYY-60型电源由北京六一仪器厂提供，精密分析天平、磁力搅拌器和恒温摇床(THZ-100型)由上海一恒科学仪器公司提供，Centrifuge 5418R型台式离心机由Eppendorf公司提供，BACTEC FX全自动血培养系统及需氧微生物培养瓶BD BACTECTM Plus Aerobic/F Culture Vials由BD公司提供，VITEK2全自动细菌药敏鉴定仪由生物梅里埃公司提供，SC-316型医用低温保存箱由赛默飞世尔公司提供；细菌基因组DNA柱式抽提试剂盒、50×TAE缓冲液、DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒、纯水(色谱级)、GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain(biotium 10 000×)、寡核苷酸引物(使用前按照说明书要求配成10 μmol/L的溶液)均由上海生物工程股份有限公司提供，LA Taq DNA聚合酶、DNA 标志物(DL2000、1 kb Ladders)、限制性内切酶BamHI、HindIII、T4-DNA连接酶、RNA酶均由Takara公司提供。

1.3方法

1.3.1细菌鉴定和药敏分析 采集患者适量血液于需氧微生物培养瓶中，上BD BACTEC FX全自动血培养系统进行培养，10～24 h血培养瓶报阳，对阳性血培养瓶进行涂片革兰染色镜检，转到相应培养基培养，挑取单克隆菌落通过VITEK2全自动细菌鉴定及药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)对菌株进行鉴定和药敏分析，大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。采用美国临床和实验室标准协会(CLSI)2019 年抗微生物药物敏感性试验执行标准(M100)肠杆菌科细菌药敏试验最小抑菌浓度(MIC)判读折点进行判读，分别进行耐药性统计。

1.3.2DNA模板的制备 大肠埃希菌接种于血平板，在37 ℃过夜进行增菌，挑取单克隆于5 mL LB液体培养基中(37 ℃ 150 r/min)过夜培养，取1.5 mL菌液离心(10 000 r/min，1 min)弃上清收集菌体，使用细菌基因组DNA提取试剂盒按说明书制备细菌基因组DNA，抽提后-20 ℃保存，作为PCR扩增的模板。

1.3.3检测由质粒介导的喹诺酮耐药基因及外排泵基因 对大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮类药物相关耐药基因[包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6′)-Ib-cr]及外排泵基因(包括oqxA、oqxB、qepA)进行检测，引物序列见表1，引物设计参照文献[2-3]。肠杆菌基因间重复性一致序列-聚合酶链反应(ERIC-PCR)使用引物ERIC2单引物扩增(AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G)，扩增反应试剂使用rTaq Premix PCR。筛查反应体系如下(总体积20.0 μL)：rTaq Premix 10.0 μL，模板1.0 μL，去离子水8.2 μL，上下游引物(10.0 μmol/L)各0.4 μL。扩增所需条件如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物经琼脂糖凝胶(1% 琼脂糖)电泳，根据电泳结果分析，将出现阳性条带的PCR扩增产物送上海生物工程股份有限公司测序分析，并经BLAST比对确认。

表1 PCR扩增引物序列

1.3.4检测乙酰转移酶Ib亚型cr变异体编码基因aac(6′)-Ib-cr 用rTaq Premix PCR反应试剂(大连宝生物)进行扩增，反应体系扩大为50.0 μL，扩增条件同质粒介导喹诺酮耐药基因检测，PCR产物送生工生物测序分析，并用软件Vector NTI advance 11(Invitrogen)分析乙酰转移酶Ib亚型aac(6′)-Ib突变情况。

1.3.5aac(6′)-Ib基因整合子定位分析 通过重叠PCR的方式，将aac(6′)-Ib基因引物(aacF+aacR)和第1类整合子可变区的引物(intF+3CS)进行交叉扩增，测序分析可变区基因盒排列，进一步验证整合子的可变区内是否有aac(6′)-Ib基因。

1.3.6菌株同源性分析 使用ERIC-PCR对50株血液分离的大肠埃希菌样进行同源性分析，引物设计见表1。PCR进行同源性分析的扩增条件为94 ℃ 4 min;94 ℃ 40 s，40 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，40个循环；72 ℃ 10 min。对所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂糖，80 V，60 min)并分析结果，成像后利用NTSYSpc 2.1e软件(聚类程序)对PCR产物的电泳模式分析，确定血液分离的大肠埃希菌的系统进化树。

2 结 果

2.1药敏结果 在收集的50株血液分离大肠埃希菌中，对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为82%和78%，同时耐药的菌株有24株，占比48%，对替加环素、多粘菌素B、哌拉西林/他唑巴坦和氨曲南/阿维巴坦的敏感性为100%，对头孢菌素类的敏感性分别为头孢吡肟(54%)、头孢噻肟(51%)、头孢他啶(76%)、头孢唑啉(57%)，对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性分别为亚胺培南(100%)、美罗培南(100%)，对氨基糖苷类抗菌药物(阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素)的敏感性均为100%。

2.2喹诺酮耐药基因检测结果 在24株环丙沙星和左氧氟沙星同时耐药的大肠埃希菌中，qnrA 基因阳性5株(20.8%，5/24)、qnrC基因阳性2株(8.4%，2/24)、qnrS 基因阳性7株(29.2%，7/24)、药物外排泵oqxB基因阳性3株(12.5%，3/24)、qnrB 基因阳性1株(4.2%，1/24)、qepA阳性1株(4.2%，1/24)、aac(6′)-Ib-cr阳性12株(50.0%，12/24)，未检出qnrD、oqxA，其中有两株分离株上述喹诺酮类耐药基因均为阴性。

2.3aac(6′)-Ib-cr检测结果 由于aac(6′)-Ib的突变型aac(6′)-Ib-cr会导致宿主菌对喹诺酮类药物耐药，故对12株aac(6′)-Ib阳性的PCR产物进行测序，并通过软件Vector NTI advance 11(Invitrogen)分析乙酰转移酶Ib亚型aac(6′)-Ib突变情况，发现有5株大肠埃希菌的aac(6′)-Ib同时发生了Trp60Arg(T180C编码)和Asp130Tyr(G390T编码)的突变，其基因型可判定为aac(6′)-Ib-cr。

2.4耐药基因定位分析结果 在耐药基因定位分析中，使用重叠PCR方法将aac(6′)-Ib的引物和整合子可变区引物两对引物交叉扩增，结果发现12株aac(6′)-Ib阳性菌株中有3株aac(6′)-Ib基因位于整合子可变区中，分别为ECO-9：aac(6′)-Ib-cmlA和dfrA1-aac(6′)-Ib-aar3-catB3；ECO-38：aac(6′)-Ib-catB8-aadA1；ECO-4：aac(6′)-Ib-cr-catB3，其中1株ECO-4(aac(6′)-Ib-cr-catB3)为可赋予宿主菌喹诺酮耐药的突变株。

2.5同源性分析结果 根据NTSYSpc 2.1e软件(聚类程序)对PCR产物的电泳模式分析确定血液分离的大肠埃希菌的系统进化树，发现50株血液分离的大肠埃希菌的进化程度不一致，ERIC-PCR电泳图亦显示带型模式多样，见图1。

注：A表示1～15号菌株电泳条带、B表示16～30号菌株电泳条带、C表示31～45号菌株电泳条带、D表示46～50号菌株电泳条带;M表示DNA标志物泳道；1～50为样本泳道。

3 讨 论

研究表明，临床上大肠埃希菌是引起感染最常见的病原菌之一，喹诺酮类抗菌药物由于具有血液浓度高、良好的抗菌活性和组织渗透性等优点，常被临床用于抗感染经验性治疗的首选药物[4-6]。随着该类抗菌药物的广泛使用，临床上喹诺酮耐药菌株不断产生，血液分离的大肠埃希菌中发现环丙沙星或左氧氟沙星耐药的情况尤其严峻。在临床分离的菌株中，革兰阴性菌对喹诺酮类抗菌药物的靶点主要体现在两个方面：(1)拓扑异构酶编码基因parC和parE基因，这两个基因可以编码拓扑异构酶Ⅳ；(2)DNA促旋酶A亚基编码基因gyrA和gyrB基因。研究发现细菌染色体上的这些基因编码区域是喹诺酮耐药决定区，该编码区域发生单个或多个碱基突变是导致细菌对喹诺酮类抗菌药物耐药的主要原因[5]。此外，新的耐药质粒介导的喹诺酮耐药基因不断被研究者所发现，较为常见的主要有qnr基因(包括亚型qnrS、qnrD、qnrC、qnrB、qnrA)，氨基糖苷甲基转移酶aac(6′)-Ib基因的突变型aac(6′)-Ib-cr基因，这些基因表达后所起的作用主要是降低宿主菌对喹诺酮类药物(环丙沙星、左氧氟沙星)的敏感性，已有研究表明菌株基因组中突变型aac(6′)-Ib-cr基因与第1类整合酶编码基因的携带率呈显著相关性，且aac(6′)-Ib-cr基因一般位于第1类整合酶可变区中[6-7]。

在本研究中，所收集到的50株非重复分离自就诊患者血液标本的大肠埃希菌中就出现了对环丙沙星和左氧氟沙星同时耐药的24株菌株，并且耐药率接近了50%，表明在发生血液感染的脓毒症患者中血液分离大肠埃希菌对环丙沙星耐药已相当严重，这将直接导致临床诊疗过程中药物疗效的降低甚至无效，应引起重视。现有研究主要集中于尿液分离的大肠埃希菌，对临床血液分离的大肠埃希菌喹诺酮耐药机制目前未见系统性报道。

对于喹诺酮类药物的耐药机制，ROBICSEK等[7]报道了质粒介导的喹诺酮类修饰酶基因aac(6′)-Ib-cr，由质粒介导的qnr类耐药基因一般定位于第1类整合子上，因其编码可以使Ⅱ型拓扑异构酶和喹诺酮抗性蛋白发生特异性的结合，从而减少宿主菌体内的喹诺酮类的药物作用的靶点，使细菌产生了耐药性[8]。目前，国内相关统计数据显示，喹诺酮类药物的用药量仅次于β-内酰胺类，菌株对喹诺酮类抗菌药物产生的耐药现象愈加明显[8]。本研究发现，从血液中分离的大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药机制的主要是质粒介导喹诺酮耐药基因在临床菌株中高水平存在，其中qnrA基因阳性5株(20.8%)、qnrB 基因阳性1株(4.2%)、qnrC基因阳性2株(8.4%)、qnrS 基因阳性7株(29.2%)、aac(6′)-Ib-cr基因阳性12株(50.0%)、qepA基因阳性1株(4.2%)、oqxB基因阳性3株(12.5%)。结果显示，质粒介导喹诺酮耐药基因中以aac(6′)-Ib-cr为主(50.0%)，为了探究这些菌株是否为相同克隆株，研究者进行了同源性分析，发现这些菌株为非克隆播散，推测耐药基因可能依靠接合性质粒导致菌株间其发生水平基因转移现象，具体质粒型别有待后续试验进一步证实。血液中分离的大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药率低于本研究从尿液样本中分离的大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药率，但本研究血液中分离的大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药率从2016-2018年呈现逐年升高的趋势。分析发现，原因在于上海交通大学附属第六人民医院南院于2013年升级为三级综合性医院，泌尿外科于2015年先后成为区市两级重点专科，收治重症患者的能力和人数大幅度提升，并加大了重症患者血培养送检率；而且统计发现泌尿外科对喹诺酮类抗菌药物的使用量亦呈现出逐年增长趋势，抗菌药物的选择压力也促使这一现象的出现。

本研究中发现1株细菌中aac(6′)-Ib-cr基因定位于第1类整合子可变区中，是aac(6′)-Ib-cr基因依赖整合子在菌株间播散的直接证据。整合子是在细菌基因组中发现的多功能基因获取系统，可以在细菌之间进行基因的水平转移，存在于众多细菌的染色体、质粒或者转座子上，且具有特定结构的一种遗传性结构元件，具有基因复杂性，产生表型多样性和能产生适应性反应的功能基因表达单位[9-10]。近年来的研究发现其在获得、表达和传播抗菌药物抗性基因方面发挥了重要作用[11]。整合子是细菌基因组中常见的外源基因捕获系统，在宿主细菌捕获、表达和传播耐药基因的过程中发挥着关键作用，革兰阴性菌中其分布尤为广泛[12-16]。本研究在血液分离的大肠埃希菌中发现aac(6′)-Ib-cr基因以基因盒的形式插入到整合子，依赖于整合子的水平转移特性进行播散，从而加快了该类耐药基因的播散，应引起临床重视。

综上所述，本研究发现在临床感染患者血液分离大肠埃希菌中，对大部分抗菌药物较为敏感，但对环丙沙星和左氧氟沙星耐药情况比较严重。试验结果显示其耐药机制以质粒介导喹诺酮耐药基因为主，aac基因占主导地位。在上海奉贤区内发现，有3株细菌aac基因定位于第1类整合子可变区，表明存在aac基因依托整合子进行院内播散的风险。其中ECO-4菌株携带的aac(6′)-Ib，可以赋予宿主菌喹诺酮抗性表型，进一步证实本院喹诺酮耐药情况存在进一步加重的潜在可能，需引起临床及院内感控部门的高度重视。