IL-6/STAT3通路在肺结核患者巨噬细胞免疫中的作用机制

鲁进 尹伶 黄汉平

1武汉科技大学医学院（武汉430081）；2鄂州市第三医院感染科（湖北鄂州436000）；3武汉市金银潭医院结核科（武汉430023）

肺结核是一种由结核分枝杆菌感染肺部引起的慢性感染性疾病，患者会出现咳嗽、咳血、体质量下降等症状，治疗不及时会危及生命［1］。调查显示，全世界人口中感染过结核分枝杆菌的人占1/3，其中大部分感染者没有特异性的临床症状，约5% ～10%的感染者不经过治疗会发展为肺结核［2-3］。WHO 相关数据表明，全球每年结核病患者人数达800 ～1 000 万例，死亡人数达300 万人，死亡率在非复合传染病中位居第一［4］。巨噬细胞是机体内的免疫效应细胞及免疫调节细胞，能吞噬病原体、分泌细胞因子并活化其他免疫细胞［5］。研究发现，巨噬细胞是结核分枝杆菌在机体内的主要存活地，结核分枝杆菌可通过调控巨噬细胞的功能保证自身存活［6-7］。白细胞介素（interleukin，IL）-6 是在细胞内广泛存在的炎症细胞因子，可通过与受体结合将信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化激活，继而参与细胞内的大量生物应答［8］。另有研究发现，结核分枝杆菌6-kDa 的早期分泌抗原靶点可以通过激活STAT3 刺激巨噬细胞产生IL-6［9］。基于此，本研究将通过检测IL-6、STAT3 在肺结核患者及巨噬细胞中的表达水平，初步探讨其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取2017年10月至2019年10月在武汉市金银潭医院接受治疗的肺结核患者92 例（观察组）作为研究对象，男52 例，女40 例，年龄46 ～74 岁，平均年龄（59.73 ± 5.46）岁，诊断符合中华医学会结核病学分会制定的《肺结核诊断和治疗指南》［10］，排除合并其他免疫缺陷疾病、其他脏器功能受损、恶性肿瘤、其他慢性疾病或近半年有过免疫治疗的患者。选取同期健康体检者95 例（对照组）作为对照，男50 例，女45 例，年龄48 ～74 岁，平均年龄（60.85 ± 5.65）岁。本研究通过本院伦理委员会审核，并所有研究对象签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器人巨噬细胞（货号：PB-MDM-002F-C）购自澳赛尔斯生物技术（上海）有限公司；结核分枝杆菌（货号：ZY-10850）购自上海泽叶生物科技有限公司；细胞裂解液（货号：BB-3207）购自上海贝博-Bestbio；BCA蛋白质定量试剂盒（货号：PA115-01）购自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清（货号：FBS500-S）购自澳大利亚AusGeneX公司；DMEM 培养基（货号：KL-P0032）购自德国merck/sigma 公司；STAT3 抗体、p-STAT3 抗体、核因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65、GAPDH 抗 体（货 号：ab109085、ab76315、ab16502、ab183559、ab181602）购自abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（货号：0295G-HRP）购自美国santa 公司；人IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）酶联免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：HL10458、HL10473、HL10038）购自上海哈灵生物科技有限公司；恒温培养箱（型号：TY10GI2-2）购自美国Shellab 公司；酶标仪（型号：MODEL550）购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达水平在晨间空腹状态下抽取两组受试者外周静脉血，分为两份。一份加入裂解液裂解30 min，4 ℃10 000 r/min 离心10 min 获得总蛋白，使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行10%SDS-PAGE 凝胶电泳，将凝胶中的蛋白质转移至PVDF 膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 封闭2 h，加入p-STAT3 抗体、STAT3 抗体、p-NF-κB p65抗体、NF-κB p65 抗体、GAPDH 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶3 000），室温孵育1 h，TBST 洗膜，化学发光法显色，凝胶成像系统显影，拍摄图像并分析条带灰度，计算目的蛋白相对表达量。

1.4 ELISA 法检测血清炎症因子水平取另一份外周静脉血，4 ℃3 000 r/min 离心10 min，取上层血清，严格按照ELISA 试剂盒说明书，采用ELISA 法检测受试者血清IL-6、IL-10、TNF-α水平，使用酶标仪测定450 nm 波长处的吸光度（optical density，OD）值，配制标准液，根据标准液吸光度结果绘制标准曲线，计算IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.5 细胞培养与分组将巨噬细胞培养于含有10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基中，置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。细胞融合至70% ～80%时传代培养。实验分为两组：正常组和感染组。正常组巨噬细胞不做处理，感染组巨噬细胞用结核分枝杆菌感染。

1.6 Western blot法检测各组巨噬细胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达水平将巨噬细胞以1×105个/mL 的密度接种于培养瓶，按1.2.3 分组处理，培养48 h，收集细胞，细胞裂解液裂解获得细胞中总蛋白，测定蛋白浓度。电泳、转膜、封闭2 h，加入p-STAT3 抗体、STAT3 抗体、p-NF-κB p65 抗体、NF-κB p65 抗体、GAPDH 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶3 000），室温孵育1 h，洗膜，显色、显影、拍摄图像、分析条带灰度，计算目的蛋白相对表达量。

1.7 ELISA 法检测各组巨噬细胞上清液中炎症因子水平将巨噬细胞以1 × 105个/mL 的密度接种于24 孔板，按1.2.3 分组处理，培养48 h，离心取上清液，ELISA 法检测上清液中IL-6、IL-10、TNF-α水平，使用酶标仪测定450 nm 波长处的OD值，计算IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.8 统计学方法数据处理采用SPSS 24.0 统计学软件。计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用成组t检验。当P＜0.05 时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组、观察组受试者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达水平与对照组相比，观察组肺结核患者外周血中p-STAT3/STAT3、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图1、表1。

图1 对照组、观察组受试者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达情况Fig.1 Expression of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood of subjects in control group and observation group

表1 对照组、观察组受试者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达水平比较Tab.1 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood between control group and observation group±s

表1 对照组、观察组受试者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达水平比较Tab.1 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood between control group and observation group±s

组别 例数p-STAT3/STAT3p-NF-κB p65/NF-κB p65对照组950.42±0.090.54±0.13观察组t 值P 值92 0.75±0.11 22.485＜0.001 0.95±0.14 20.761＜0.001

2.2 对照组、观察组血清炎症因子水平与对照组相比，观察组肺结核患者血清中IL-6、IL-10、TNF-α表达水平显著升高（P＜0.05），见表2。

2.3 正常组、感染组巨噬细胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达水平与正常组相比，感染组巨噬细胞中p-STAT3/STAT3、p-NFκB p65/NF-κB p65 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见图2、表3。

图2 正常组、感染组巨噬细胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达情况Fig.2 Expression of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group

表2 对照组、观察组受试者血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平比较Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6，IL-10 and TNF-α between the control group and the observation group ±s

表2 对照组、观察组受试者血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平比较Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6，IL-10 and TNF-α between the control group and the observation group ±s

组别 例数IL-6（ng/mL）IL-10（ng/mL）TNF-α（pg/mL）对照组9533.59±2.56237.03±10.8877.61±6.95观察组9282.16±4.74366.92±10.64172.35±7.87 t 值P 值87.559＜0.001 82.507＜0.001 87.327＜0.001

2.4 正常组、感染组巨噬细胞上清液中炎症因子水平与正常组相比，感染组巨噬细胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表达水平显著升高（P＜0.05），见表4。

3 讨论

肺结核的发病与免疫功能有关，免疫功能长期低下的人群更容易并发肺结核，而肺结核的主要免疫机制与细胞免疫有关［11］。肺结核是由结核分枝杆菌感染肺部引发的传染性疾病，其致死性仅次于艾滋病，结核分枝杆菌感染后，巨噬细胞会分泌大量的细胞因子，将淋巴细胞、单核细胞活化，进而杀灭结核分枝杆菌［12］。流行病学数据显示，尽管全球1/3 左右的人感染过结核分枝杆菌，其中发展为肺结核的感染者仅占5% ～10%，这种现象也表明患者机体的免疫系统在控制结核分枝杆菌感染方面发挥了重要作用［2］。然而，巨噬细胞作为基础免疫细胞，在吞噬、灭杀结核分枝杆菌的同时，由于结核分枝杆菌感染后作用于巨噬细胞的一系列机制，导致对结核分枝杆菌杀伤力降低，同时给结核分枝杆菌在人体内的长期存活提供了有利环境［13-14］。为了提高感染结核分枝杆菌后的免疫功能，深入了解肺结核患者巨噬细胞免疫的具体机制具有重要意义。

表3 正常组、感染组巨噬细胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达水平比较Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group ±s

表3 正常组、感染组巨噬细胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表达水平比较Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group ±s

组别p-STAT3/STAT3p-NF-κBp65/NF-κBp65正常组0.36±0.070.79±0.07感染组t 值P 值0.82±0.09 9.882＜0.001 0.93±0.08 3.226 0.009

表4 正常组、感染组巨噬细胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表达水平比较Tab.4 Comparison of expression levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in macrophage supernatant of normal group and infection group ±s

表4 正常组、感染组巨噬细胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表达水平比较Tab.4 Comparison of expression levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in macrophage supernatant of normal group and infection group ±s

组别IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）TNF-α（pg/mL）正常组176.02±12.48535.82±20.07245.44±13.55感染组t 值P 值285.69±14.31 14.1480＜0.001 794.56±20.56 22.058＜0.001 374.12±16.79 14.609＜0.001

IL-6 是一种由巨噬细胞及T 淋巴细胞分泌的具有促炎作用的白细胞介素，参与免疫反应，是STAT3 经典的上游激活因子，可以改变STAT3 蛋白质构象，促进STAT3 磷酸化，进而激活NF-κB 信号通路，调控炎症细胞因子表达［15-16］。IL-10 是常见的抑炎因子，可抑制炎性细胞因子产生及抗原特异性T 细胞的激活［17］。TNF-α是常见的促炎因子，在免疫性肝损伤过程中受到NF-κB 信号通路的调控［18］。HARLING 等［19］研究表明，与健康接触者相比，结核病患者IL-6、IL-10 表达水平均显著升高，可能是由致病细胞因子引起的。本研究结果显示，观察组肺结核患者外周血中STAT3 磷酸化、NF-κB磷酸化蛋白水平及血清中IL-6、IL-10、TNF-α表达水平均显著升高，提示肺结核患者外周血中炎症反应平衡紊乱，促炎、抑炎机制均被激活。

巨噬细胞在肺结核发生发展过程中扮演重要角色。一方面，作为免疫系统中的基础免疫细胞，在病原菌结核分枝杆菌感染后攻击、吞噬结核分枝杆菌，或激活细胞免疫应答反应，诱导其他细胞因子释放及T 淋巴细胞聚集，增强对结核分枝杆菌的攻击作用［20］。另一方面，结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬后，可诱导泡沫巨噬细胞形成，导致巨噬细胞的表型、功能均发生改变，不仅降低了对结核分枝杆菌的吞噬、杀伤能力，还会抑制抗结核分枝杆菌特异性免疫应答的产生［21］。本研究采用结核分枝杆菌感染巨噬细胞发现，巨噬细胞中STAT3 磷酸化、NF-κB 磷酸化蛋白表达水平及IL-6、TNF-α表达水平均显著升高，提示巨噬细胞被结核分枝杆菌感染后可能分泌IL-6，促进STAT3 蛋白磷酸化，进而激活NF-κB 蛋白，导致炎症因子TNF-α水平升高，同时，结核分枝杆菌通过诱导巨噬细胞分泌IL-10 抑制免疫反应，以保证自身存活［22］。

综上所述，肺结核患者外周血及感染结核分枝杆菌的巨噬细胞上清液中IL-6 表达水平升高，可能通过促进STAT3 蛋白磷酸化激活NF-κB 通路，提高免疫反应。