缺糖缺氧心肌细胞中miRNA-155对Notch信号通路及自噬和凋亡的影响

陈希妍 马彦娟 牛丽丹 杨亚琴 杨飞云 石金河

新乡医学院第一附属医院急诊科（河南卫辉453100）

miRNA 是一类长度为19～25 nt 的非编码单链小分子RNA，在心脏重塑、血管细胞收缩、心肌收缩以及脂质代谢等心血管疾病中发挥重要的调控作用［1-2］。miRNA-155 与动脉粥样硬化存在着密切关系［3］，并且其还参与心肌细胞损伤，下调miRNA-155 水平可减轻心肌细胞损伤程度［4］。以往的研究［5-6］显示，Notch 信号通路参与缺氧/复氧所诱导的心肌细胞损伤，骨髓间充质干细胞条件培养液通过Notch2/mTOR/自噬信号途径保护心肌细胞免受缺氧/复氧损伤［7］。miRNA-381 通过抑制Notch 信号通路负性调节心肌细胞存活［8］。研究显示Notch 信号通过调节细胞自噬发挥细胞的保护作用［9］，而抑制miRNA-155 表达可通过上调自噬作用减轻氧化损伤，促进细胞增殖［10］。miRNA-155 是否是通过对Notch1 信号通路的影响而发挥细胞保护作用，还未见报道。本研究以H9C2 细胞为研究对象，建立缺糖缺氧细胞模型，检测miRNA-155 与Notch1 信号通路及细胞自噬，凋亡的关系，将为临床心肌细胞缺血、缺氧的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验细胞大鼠心肌细胞H9C2 细胞株购自于协和细胞库

1.2 主要试剂miRNA-155 inhibitor、转染试剂体LipofectamineTM2000，购自于苏州吉玛基因公司。Notch1 抗体，HES1 抗体购自于SANTA Cruz 公司，Beclin1 抗体，cleaved-Caspase-3 抗体购自于Abcam公司，GAPDH 抗体购自于Sigma 公司

1.3 心肌细胞的培养H9C2 细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养基中（含100 U/mL 青霉素及0.1 mg/mL 链霉素），置于37 ℃、5 % CO2的恒温培养箱中，2～3 d 传代1 次，实验所用细胞均为对数生长期细胞。

1.4 缺氧缺糖细胞模型的建立及实验细胞分组将H9C2细胞正常培养（37 ℃、5%CO2的恒温培养）24 h后，更换成不含血清的低糖DMEM 培养基低氧条件下（1%O2、95%N2、5%CO2）培养24 h。正常对照组，缺氧缺糖组（OGD group），缺氧缺糖+阴性对照miRNA-155 inhibitor 组（转染阴性对照miRNA-155 inhibitor 后缺氧缺糖条件培养24 h）（OGD +miRNA-155 inhibitor negative control group），缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 组（转染miRNA-155 inhibitor 后缺氧缺糖条件培养24 h）（OGD + miRNA-155 inhibitor group）。

1.5 RT-qPCR 检测miRNA-155 mRNA 的表达分别提取正常对照组与OGD 组心肌细胞总RNA，利用RT-qPCR 检测两组细胞中miRNA-155 mRNA的表达变化，（miRNA-155-F CGCGTTAATGCTAATCGTGAT；miRNA-155-R CGCGTTAATGCTAATCGTGAT），按照逆转录试剂盒的操作说明将RNA逆转录成cDNA，以cDNA 为模板进行扩增，RT-qPCR 反应条件：预变性94 ℃30 s，变性94 ℃5 s、退火56 ℃30 s、延伸72 ℃30 s，共40 个循环。

1.6 心肌细胞转染按照转染试剂的使用说明，利用转染试剂分别将miRNA-155 inhibitor ，阴性对照miRNA-155 转染至H9C2 细胞中。

1.7 Western blot 检测细胞中Notch1，HES1 及Beclin1，cleaved-Caspase-3的表达变化收集正常对照组，缺氧缺糖组（OGD group），缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 阴性对照组与缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 组细胞，利用RIPA 裂解液裂解细胞，提取总蛋白。常规SDS-PAGE 电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，Notch1 抗体（1∶500），HES1 抗体（1∶500），Beclin1抗体（1∶500），cleaved-Caspase-3 抗体（1∶1 000）及GAPDH 抗体（1∶10 000）4 ℃孵育过夜，荧光Ⅱ抗（1∶1 000）室温孵育2 h 后，Odyssey 曝光，Image J 软件分析灰度值。

1.8 心肌细胞活性的检测将H9C2 按照5 × 103的密度接种于96 孔板中，按照上述方法将细胞分为4 组，在缺氧缺糖诱导24 h 后检测各组活性，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，正常培养条件下继续孵育3 h，酶标仪450 nm 处测OD值。

1.9 统计学方法利用SPSS 17.0 软件进行数据分析处理，实验数据以均数±标准差表示，两样本数据比较采用t检验，多样本数据比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 正常对照组与OGD组心肌细胞中miRNA-155 mRNA 的表达变化利用RT-qPCR 检测了2 组细胞中miRNA-155 mRNA 的表达情况，结果如图1 所示，与正常组相比较，OGD 组心肌细胞中miRNA-155 mRNA 的表达显著升高（P＜0.01）。

图1 利用RT-qPCR 检测miRNA-155 mRNA 在2 组细胞中的表达Fig.1 The expression of miRNA-155 mRNA in two groups was detected by RT-qPCR

2.2 Notch1、HES1、Beclin1、Caspase-3 在各组细胞中的表达情况利用Western blot 检测了正常对照组、OGD 组、OGD+miRNA-155inhibitor 阴性对照组及OGD + miRNA-155 inhibitor 组心肌细胞中Notch1、HES1、Beclin1、cleaved-Caspase-3 蛋白的表达情况（图2），与正常对照组相比较，OGD 组心肌细胞中的Notch1、HES1 蛋白的表达显著降低（P＜0.01），而Beclin1 与cleaved-Caspase-3 蛋白的表达显著升高（P＜0.001）；与OGD 组相比较，转染miRNA-155 inhibitor 后，心肌细胞中的Notch1，HES1 及Beclin1 蛋白的表达显著升高（P＜0.05），而cleaved-Caspase-3 蛋白的表达显著降低（P＜0.01）。提示miRNA-155 负向调节Notch1 信号通路的激活，促进细胞自噬，抑制细胞凋亡，从而发挥细胞保护作用。

图2 Western blot 检测Notch1、HES1、Beclin1、cleaved-Caspase-3 蛋白在4 组细胞中的表达Fig.2 The expression of Notch1，HES1，Beclin1and cleaved-Caspase-3 in four groups was detected by Western blot

2.3 CCK-8实验检测各组心肌细胞的活性CCK-8实验结果显示，与正常对照组相比较，OGD 组细胞的活性显著降低（P＜0.01）；而与OGD 组相比较，转染miRNA-155 inhibitor 后，细胞的活性则显著升高（P＜0.05），miRNA-155 inhibitor 阴性对照组细胞的活性差别无统计学意义（P＞0.05，图3），这就提示在缺氧缺糖情况下，抑制miRNA-155 后，通过促进Notch1 信号的激活，提高心肌细胞的活性。

3 讨论

急性心肌梗死（acute myocardial infraction，AMI）是由于血栓或冠状动脉粥样硬化斑块的急性改变引发冠状动脉闭塞，导致心肌细胞严重缺血缺氧的心血管疾病［11］，严重威胁着人类的生命健康。microRNAs 是一类在许多生物学过程中是必不可少的非编码的RNA，在细胞增殖、分化和凋亡过程中起着关键作用［12-14］。作为一种多功能的miRNA，miRNA-155 不仅在肿瘤的生长中发挥作用［15］，更有研究显示其在心脑血管疾病中发挥重要作用［10］，miRNA-155 表达减弱可减轻氧化损伤，通过上调细胞自噬促进细胞增殖［10］。miRNA-155 异常表达对脑缺血产生显著影响，其可通过Notch 信号通路对脑缺血再灌注损伤产生影响［16］，而其在心肌细胞的缺血缺氧损伤中的作用机制还不清楚。

图3 各组心肌细胞的活性。Fig.3 The viability of cells in each group

本研究通过建立心肌细胞缺血缺氧模型，检测miRNA-155 在心肌细胞中的表达变化，结果显示，与正常对照组相比较，模型组细胞中miRNA-155 的表达显著升高，差异有统计学意义。

越来越多的研究表明，Notch 信号通路心血管疾病中发挥着心肌细胞保护作用［17-18］，孔令宇等［9］的研究显示，Notch 信号通过调节细胞自噬发挥细胞细胞的保护作用。本研究通过抑制miRNA-155的表达检测缺糖缺氧的心肌细胞中Notch1、HES1、自噬相关蛋白Beclin1、Caspase-3 蛋白的表达，结果显示，抑制miRNA-155 的表达后，缺糖缺氧的心肌细胞中Notch1，HES1，自噬相关蛋白Beclin1 的表达均显著升高，而Caspase-3 蛋白的表达显著下降；CCK-8 实验结果显示，与模型组相比较，抑制miRNA-155 的表达后，心肌细胞的活性显著升高。

综上所述，在缺血缺氧条件下，抑制miRNA-155 的表达可促进Notch 信号通路的激活，促进心肌细胞自噬，减少细胞凋亡，减轻心肌细胞的损伤，增强细胞活性，从而发挥对心肌细胞的保护作用。