利用单细胞技术探究肿瘤相关巨噬细胞的特征

代艳 包梦颖 曾燕玉 刘云 叶雨

1广西医科大学第二附属医院（南宁530007）；2广西基因组与个体化医学研究重点实验室（南宁530022）；3广西医科大学第一附属医院骨科（南宁530021）

巨噬细胞在多种疾病的发病机制中扮演重要角色，既往研究表明它除了对病原体、慢性炎症、纤维化和癌症有防御作用，还具有调节造血微环境、影响机体代谢、介导组织修复和监视胚胎组织的成熟等非免疫作用［1］。巨噬细胞表型最初被划分为M1 和M2，其中M1 抗炎及阻止肿瘤进展，而M2 发挥抗炎、组织重塑及免疫抑制，促进肿瘤的进展和侵袭［2］。近年来发现，有少数巨噬细胞表型并不归属于传统的M1 或M2 类，在宿主免疫系统中也具有重要功能，包括：肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）、CD169+及TCR+巨噬细胞，它们分布位置不同，且在不同的疾病发生发展中具有各自的功能和特点［2］。TAMs主要是指浸润在肿瘤组织或填充在实体肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）中的巨噬细胞，在肿瘤中受高度关注。以往认为大部分TAMs 极化为M2 型［3］。最近的报道表明，区分经典极化的抗肿瘤M1 和交替极化的促肿瘤M2 亚型的模型并不能完全解释体内的TAMs 表型多样性［4］，TAM 的定义及其功能一直颇具争议。单细胞技术可以从单个细胞层面研究TAMs 的可塑性及TAMs 与恶性细胞和肿瘤浸润的T 细胞之间的交互作用，这将为探索潜在的以TAMs 为治疗中心的免疫治疗提供理论依据。

1 单细胞技术原理及其应用

目前常用的单细胞技术主要是质谱流式技术（mass cytometry by time-of-flight，CyTOF）和单细胞RNA 测序（single-cell mRNA sequencing，scRNAseq），见图1。CyTOF 可同时检测数百万单个细胞中的40 多个蛋白标记物，既类似于低维流式细胞仪的经典分析方法，也类似于单细胞测序的高维方法，对于理解TME 复杂性有帮助［5］。scRNA-seq则提供无偏见的策略来描述单个细胞的转录组特征，基于不同平台可有很多方法可供选择，比如使用全长测序方法（如Smart-seq2）高敏感度可检测到更多的基因数或3′端测序方法（如CEL-Seq2和MARS-seq）更少的放大噪音量化了mRNA 水平，以及基于drop 的方法（如Drop-seq、InDrop 和10×Chromium Genomics）［6-7］增加测序通量。单细胞测序技术已应用于胚胎发育、神经生物学、肿瘤、免疫、微生物、嵌合体分析等多个研究领域［8-9］，以及在多组学上探究单个肿瘤细胞的异质性和基因突变，还可用于临床中肿瘤耐药机制的研究，深入理解肿瘤发生、发展的过程［10］。目前利用单细胞技术探究巨噬细胞及其亚群标记物的文献总结见表1。

2 CyTOF 技术对TAMs 的特征探索

肿瘤生态系统可受到细胞相互作用的影响，而针对促进肿瘤发展的细胞间作用的治疗策略具有相当大的前景。很多研究是针对耗竭性T 细胞（Exhausted T cells，TEx）和调节性T 细胞（regulatory T cells ，Tregs）的免疫检查点进行抑制［21］，而T 细胞的耗竭可被TAMs通过共刺激受体调节。在80%的肿瘤中，至少10%的髓系细胞为PD-L1+［22］，TAMs可以通过免疫抑制作用（如PD-L1 表达）来调节肿瘤生态系统［23］。

图1 scRNA-seq 和CyTOF 技术的流程和分类Fig.1 Flow and classification of SCRNA-SEQ and CyTOF techniques

表1 基于单细胞技术定义的巨噬细胞亚群Tab.1 Macrophage cell subsets identified based on the integrated single-cell studies

LAVIN 等［14］通过CyTOF 技术绘制了早期肺腺癌TME 中免疫细胞的详细图谱，发现巨噬细胞主要在肿瘤侵袭边缘聚集成致密簇，并且高表达PD-L1，有研究表明TME中PD-L1及TAMs的表达与非小细胞肺癌（NSCLC）患者的预后密切相关［24］。另一项对人肾脏透明细胞癌的研究发现所有TAMs 表达促肿瘤（CD206、CD204、CD163）和抗肿瘤（CD169）标记物［12］。有一群TAMs 表达CD38，具有编码T 细胞衰竭的PD-1 的配体PDCD1LG2 和CD274 及吸引CD8+T 细胞和Treg 的趋化因子CCL8和CXCL10的免疫抑制特征，而另两群TAMs虽与这类TAMs 共享大部分特征，但不表达CD38、无免疫抑制特征，说明CD38在调控T细胞活性中的重要作用。又一项对于人乳腺癌的研究也发现PD-L1+TAMs 的特征类似于肾癌，主要在3 级肿瘤中富集，进一步分析发现PD-L1+TAM 与Tregs 和PD-1highCTLA-4+CD38+TEx 表型相关，均表现出免疫抑制且相互作用［17］。HARTER 等［25］研究表明，PD-L1+TAM 的存在与Tregs 的比例有关，而Tregs 分泌的细胞因子如IL-10、IL-4 和IL-13，可能会触发免疫抑制特性的TAMs 的发展［3］。综上所述，TAMs 与Tregs 之间的细胞交互作用有希望成为治疗方向。

3 利用scRNA-seq技术对TAMs特征的探索

最初，CHUNG 等［26］在原位乳腺癌中发现TAM主要以免疫抑制的M2 特征为主，这种TAM 通过促进血管生成和抑制免疫监视来促进肿瘤发展。最近有研究提出TAMs 可共表达M1 和M2 标志物，这一观念的提出对传统的M1 和M2 分类方式产生巨大的冲击，传统的分类方式已经无法体现巨噬细胞的异质性。

3.1 TAMs 还表现共表达M1 和M2 相关基因的特征TME 中的TAMs 具有广泛异质性，MÜLLER等［13］在神经胶质瘤中以嘌呤能受体（如P2RY12）标记小胶质细胞来源的TAMs，而以CD49D（由ITGA4 编码）标记血源性TAMs，发现TAMs 共表达M1 和M2 基因，揭示了血源性TAMs 浸润数量与低级别胶质瘤存活率呈显著负相关，提出区分TAMs及针对免疫抑制血源性TAMs 的治疗策略。AZIZI等［11］和LAMBRECHTS 等［27］在乳腺癌和肺癌也发现TAMs 相似的特征，并为连续表型，这挑战了传统的巨噬细胞的激活与极化模型，比M1 和M2 状态共存的模型更进一步揭示这种共表达特征在很多肿瘤中是共存的。

3.2 10XGenomics 与Smart-seq2 结合分析肿瘤中TAMs 的特征一些学者将10XGenomics 与Smartseq2 方法结合多组织整合分析，既比较两种方法的综合分析能力，也从高分辨率角度了解肿瘤中TAMs 的表型及追踪其在不同组织中的动态。ZHANG 等［19］发现主要富集于肿瘤组织的骨髓源性抑制细胞样巨噬细胞和TAM 样巨噬细胞，其中TAM 样巨噬细胞表现为M1 和M2 特征共存，比经典的M1/M2 更加复杂。它表达的基因SLC40A1 和GPNMB 与预后不良有关，这种TAMs 可能是一种潜在的靶向治疗癌症的候选细胞。ZHANG 等［20］在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）中鉴定了两个不同的TAMs，包括C1QC+和SPP1+TAMs，这两个种群都不符合M1 和M2 的二分体表型。SMILLIE 等［28］发现在溃疡性结肠炎和健康个体的结肠黏膜中只有C1QC+TAMs，而促血管生成的SPP1+TAM 仅富集在CRC 患者癌组织中，提示其可能在CRC 发生发展中发挥重要作用。使用Anti-CSF1R 抑制剂只减少部分C1QC+TAM，保留了SPP1+TAMs，这可能是Anti-CSF1R 单药治疗肿瘤效果不佳的原因。综上所述，个性化探索TAMs 在不同的肿瘤中特征和功能可为精准免疫治疗提供线索。

4 单细胞技术与RNA 测序技术在研究TAMs 中的优势

RNA 测序（RNA-seq）［29］是一种基因组方法，通常检测成千上万个混合细胞的总RNA 量来估计不同基因的表达水平，忽视了单个细胞间的异质性。而scRNA-seq 更关注细胞的异质性，无偏性分析可解决TAM的复杂性。CyTOF和scRNA-seq平台是对正常和肿瘤样本中复杂免疫系统的分析，这些研究开始系统地揭示不同比例和亚型的免疫细胞［30］，比如揭示NSCLC 组织中介导单核细胞向M2 分化的关键转录因子［31］。在肿瘤的不同分级和亚型中识别鉴定血液来源及组织驻留的巨噬细胞的标记，比较其标记物的差异表达，以便了解肿瘤中主导的免疫抑制类群以及设计更有效的精准治疗方法［13］。许涛等［32］分析三阴性乳腺癌（TNBC）中巨噬细胞的关键标记基因，为TNBC 患者的靶向与免疫治疗提供思路。scRNA-seq 和总RNA-seq联合分析TNBC［33］，通过scRNA-seq 发现高比例的M2 样TAMs。再采用bulk RNA-seq 分析TAMs 与生存之间的关系。采用多种生物信息学方法建立TAM 相关基因标记来预测生存和免疫治疗反应，为开发新一代TNBC 的免疫疗法和精准治疗提供依据。研究组织中同类型细胞间的差异性，单细胞技术可能是更为合适的研究方式，但传统的测序方法也有其价格及对样本的要求低的优势，需根据自身的研究需要合理选择适合的研究方法。

5 单细胞技术的不足

CyTOF 依赖多种抗体，无法区分肿瘤组织、健康邻近组织和血管特异性免疫细胞表型。scRNAseq 也存在限制和条件，首先是可能产生因实验重复在不同时间或从不同平台生成的数据等引起的批次效果［34］；其次是基于drop 的测序方法每个细胞只能捕获小部分转录组；而且有时mRNA 与蛋白质的表达水平不一致。此外，组织消化会使细胞产生应激，改变某些基因的表达和细胞表面分子；组织样本取材不同和解离过程，导致获取的表达信息不能映射到解剖位置或者细胞结构。因此，单细胞技术需要克服它的局限性，将TME 的细胞、分子和结构信息结合展现。

6 总结与展望

本综述讨论了利用单细胞技术在不同肿瘤组织中对巨噬细胞群体的探究，更好地了解在不同肿瘤中巨噬细胞的表型和功能多样性。它们与疾病、患者的临床特征和未来事件的关系可能有助于理解疾病的发病机制及为肿瘤未来的靶向治疗提供理论基础。此外，在未来的人类肿瘤研究中，将转录组数据集与临床数据关联，包括病灶特征（如细胞含量及免疫细胞浸润程度、浸润部位）、肿瘤分期等，而且应进一步描述巨噬细胞亚群。应用本综述中描述的不同组织中巨噬细胞类群及一系列标记物，未来CyTOF 实验可能证实并详细说明巨噬细胞群体在人肿瘤中的存在及功能。此外，亚群特异性标记也可以应用于区分群体的不同状态和随后具有详细特征的细胞表型。未来可结合scATAC-seq（染色质开放区）和scCHIP-seq（特定组蛋白标记）对表观基因组景观进行研究，以进一步揭示特异巨噬细胞亚群及它们的调控途径，如表观遗传过程和控制它们的转录因子。

总之，未来单细胞技术的方向将是单细胞多组学分析，可从同一个单细胞中获得转录组、甲基化组和表观基因组，分析细胞的异质性、疾病转移的分子特征、细胞间的相互作用，比较不同疾病阶段和治疗前后免疫细胞亚群之间的基因表达和分化途径的差异。此外，空间转录组学可还原单个细胞的解剖信息。因此，可以绘制肿瘤浸润免疫细胞动态工作的图谱，这将是改进免疫疗法和支持新疗法发展的第一步，将为加速这一方向的研究提供有价值的资源。