miR-1290与RASAL2基因靶向关系的探索

谭 芳， 胡 娟， 李 擎， 杨晓燕， 雷小勇

(南华大学湖南省分子靶标新药研究协同创新中心 南华大学药物药理研究所，湖南省衡阳市421001)

RASAL2蛋白是由RASAL2基因编码的一种RAS-GTP酶活性蛋白(RAS GTPase activating protein， RASGAP)[1]。RASGAP主要负责促进RAS基因RASGTP酶的活性，既往研究发现人类20%～30%的肿瘤发生是由于RAS突变而导致的三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate, GTP)水解发生障碍[2-4]。 而RASAL2作为RAS基因的一个重要的活性蛋白，主要作为一个抑癌因子参与肿瘤进展。然而，调控RASAL2表达的具体机制尚不清楚。

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)作为一类单链非编码RNA，长度约为22个核苷酸，具有高度保守性。研究发现，miRNA主要通过与靶基因mRNA的3′-非翻译区(3′-untranslated region，3′-UTR)碱基互补配对，来阻碍靶基因mRNA翻译成蛋白质或导致其降解，这属于在转录后水平的一种调控基因表达的方式[5-8]。大量研究表明，miRNA 在肿瘤细胞增殖、凋亡、转移、耐药等各种生理病理过程中发挥关键作用[9-11]。本课题组通过在线数据库Targetscan发现，RASAL2 3′-UTR可能存在与miR-1290互补配对的结合序列。miR-1290在肿瘤细胞中表达异常，参与了多种恶性肿瘤的发生发展。研究发现，miR-1290能够与hMSH2、FOXA1、NFIX等多种基因3′-UTR区结合进而调控相关基因的表达[12-14]。然而，miR-1290与RASAL2之间是否存在靶向调控机制还不清楚。因此，本研究以miR-1290为研究对象，采用双荧光素酶报告基因系统来证实其与RASAL2基因的靶向关系，希望能为miR-1290在肿瘤中调控机制的研究工作奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人肾上皮细胞293T购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；引物合成委托上海捷瑞生物工程有限公司完成；TOP10感受态细胞、GV272载体及miR-1290质粒均购于上海吉凯基因。主要试剂：高糖培养基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)(Corning cellgro)、胎牛血清和Opti-MEM培养基购自Gibco公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent购自Roche公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶XbaI/XbaI均为New England Biolabs公司产品；荧光定量PCR试剂盒为TaKaRa公司产品；无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技有限公司；双荧光报告检测系统购自Promega公司。

1.2 仪器

CO2培养箱(cat.No: MCO-175，SANYO)；荧光显微镜(cat.No: IX71，奥林帕斯)；离心机(cat.No: Fresco 21，赛默飞世尔科技有限公司)；酶标仪(cat.No: M2009PR，Tecan infinite)；倒置显微镜(cat.No: XDS-100，上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.3 生物信息学软件预测miR-1290的靶基因

利用Targetscan数据库搜索与miR-1290种子区匹配的保守位点，预测miR-1290的潜在靶基因。

1.4 野生型与突变型RASAL2双荧光素酶报告基因质粒的构建

利用NCBI数据库获取RASAL2基因3′-UTR碱基序列，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成相应的扩增引物序列，RASAL2上游引物：5′-GAGGAGTTGTGTTTGTGGAC-3′，下游引物：5′-GACGATAGTCATGCCCCGCG-3′。提取293T细胞总RNA，反转录反应得到基因组DNA，进行PCR扩增反应最终合成3′-UTR序列片段，利用XbaI/XbaI内切酶在相应识别点进行酶切、纯化后，与GV272载体连接。然后重新将质粒转化至TOP10感受态细胞，鉴定阳性克隆转化子，并用含氨苄霉素的LB液体培养基在37 ℃培养箱中培养12～16 h，进行琼脂糖凝胶电泳纯化回收。取适量菌液进行测序鉴定。

1.5 双荧光素酶活性检测

将呈指数式生长的293T细胞消化并吹打成悬液，并接种于24孔培养板中，每孔接种细胞数为105个，置于37 ℃、5% CO2培养箱中至细胞融合度约60%～70%，参照X-tremegene HP转染试剂说明书进行转染操作：①将X-tremegene HP转染试剂和质粒按每孔1 μg∶2 μL的比例移至100 μL opti-MEM中，充分混匀，静置20 min；②弃掉培养板中旧培养基，将转染试剂X-tremegene HP混合液与质粒移至细胞培养板，孵育5～6 h后，每孔补加培养基(含10% FBS)200 μL。③48 h后，弃全部培养液，并加入1× Passive Lysis Buffer 300 μL，4 ℃条件放置20 min，使293T细胞裂解完全，轻轻地震荡3～5 min，混匀后，吸取40 μL细胞裂解液，加入20 μL Luciferase Assay Reagent，于检测板中再次震荡，上机检测荧光素酶活性；④检测完毕后，向每孔中加入20 μL Stop & Glo®Reagent，混匀后，静置3 min，检测海肾荧光酶活性，接着进行结果定量分析。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 miR-1290与RASAL2 3′-UTR互补结合位点预测

通过在线数据库Targetscan预测RASAL2是否为miR-1290可能的靶基因，结果发现，miR-1290与RASAL2 3′-UTR存在碱基互补序列，是一个潜在结合位点(图1)。

图1 miR-1290与RASAL2互补结合的靶位点

2.2 PCR扩增与酶切产物鉴定

琼脂糖凝胶电泳实验表明，野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR及突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR双荧光素酶报告质粒PCR扩增产物片段大小一致，代表质粒构建成功(图2)。经XbaI/XbaI内切酶酶切后，载体片段和不同长度的启动子片段相对分子质量均一致，说明质粒被成功构建(图3)。

图2 RASAL2基因3′-UTR重组质粒PCR琼脂糖电泳结果M为DNA Marker;1为RASAL2-wt 3′-UTR PCR扩增物；2为RASAL2-mut 3′-UTR PCR扩增物。

图3 荧光素酶报告基因质粒琼脂糖电泳结果1为空载体-阴性对照；2为GAPDH-阳性对照；M为Marker；3～5为RASAL2野生型重组质粒酶切产物；6～8为RASAL2突变型重组质粒酶切产物。

2.3 RASAL2基因野生型及突变型报告质粒测序结果

通过比较图4中的RASAL2基因3′-UTR野生型测序峰图和图5 RASAL2基因3′-UTR突变型部分测序峰图可知，已成功将靶序列AAAATCC(6245～6252)突变为CCCCGAA。说明两种质粒构建成功。

2.4 双荧光素酶活性验证

如图6所示，与野生型质粒(GV272-RASAL2-wt 3′-UTR)+miR-NC组相比，野生型质粒(GV272-RASAL2-wt 3′-UTR)+miR-1290组的相对荧光素酶活性差异无显著性(P=0.053)，说明miR-1290不能与RASAL2基因3′-UTR结合，进而无法抑制其表达；而突变型质粒(GV272-RASAL2-mut-3′-UTR)+miR-1290组的相对荧光素酶活性相较于突变型质粒(GV272-RASAL2-mut 3′-UTR)+miR-NC组无显著变化。以上说明miR-1290与miR-NC均无法抑制突变型质粒荧光素酶活性。

图4 RASAL2基因3′UTR野生型部分测序图

图5 RASAL2基因3′UTR突变型部分测序图

图6 miR-1290对RASAL2基因3′-UTR相对荧光素酶活性的影响

3 讨 论

RASAL2蛋白在肿瘤发生发展中通常作为一种抑癌因子发挥作用。然而，调控RASAL2表达的机制尚不清楚。因此，本研究借助在线预测数据库寻找到一些对RASAL2基因具有靶向调控作用的miRNA。近年来，随着测序技术的发展，更多的miRNAs被发现，但对于它在疾病中的调控机制和生物学功能仍值得深究[15]。一些研究证实，一个miRNA 可与多种mRNA结合，而不同miRNA也可能竞争同个mRNA结合位点。近年来， miRNA在肿瘤发展中的关键作用得到重视。miR-1290在急性淋巴细胞白血病、肺癌及胃癌等多种恶性肿瘤中均发挥抑制作用[13,16-17]。因此，成功预测并验证调控RASAL2基因表达水平的miRNAs，进一步阐明其在胃癌中调控机制及对胃癌细胞的表型影响，这将有利于胃癌的临床治疗，并为发现新的肿瘤标志物及分子靶点提供思路。

双荧光素酶报告基因检测和蛋白免疫印迹是目前较常用于miRNA靶基因验证的方法[18-19]。本研究采用生物信息学预测方法，结合荧光素酶报告基因实验验证，通过将目的基因RASAL2 3′-UTR序列插入GV272载体，利用miRNA阴性对照及靶基因RASAL2 3′-UTR结合位点定点突变，通过检测荧光素酶活性来验证miR-1290与RASAL2 3′-UTR结合情况。结果表明：miR-1290对RASAL2基因 3′-UTR荧光素酶活性无明显抑制，初步证实了RASAL2与miR-1290不存在靶向关系。因此，RASAL2的抑癌作用可能是通过其他调控机制或受miR-1290的间接调控，而并非靶向调控。

本研究成功构建了RASAL2基因3′-UTR的双荧光素酶报告载体，并确证了miR-1290与RASAL2基因不存在直接靶向关系。