玉米苞叶黄酮的提取纯化及其抗氧化性能研究

2021-03-17芮怀瑾燕传勇聂锦涛

农产品加工 2021年3期

芮怀瑾，刘郁，白云，燕传勇，张锋，周颖，聂锦涛

（1. 徐州工业职业技术学院化学工程学院，江苏徐州 221140；2. 南京农业大学，江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏南京 210095）

玉米苞叶是植物玉米的外苞叶，不仅是玉米植株进行光合作用、贮藏光合产物的器官，而且为雌穗的生长提供优质的生存条件[1]。我国是世界范围内玉米种植生产大国，2019 年我国玉米产量高达26 077 万t，玉米苞叶资源丰富，据统计每公顷玉米可采收玉米苞叶600 kg 左右。有研究发现，玉米苞叶中富含生物活性物质，如黄酮、花青素、花色苷、多糖等，具有清除自由基、调节血脂、预防动脉粥样硬化、降血糖、抑制α - 糖苷酶等药理作用，具有较好的医疗保健作用[2-5]。然而，一直以来玉米苞叶在我国多被用来燃烧或作为饲料使用，造成严重的资源浪费和环境污染。张沐新等人[6]对玉米苞叶黄酮进行分离鉴定发现，玉米苞叶中黄酮物质类型丰富，具有较高的深入研究价值。吴春等人[7]研究发现，2 mg/mL 的玉米苞叶黄酮纯化物溶液对大肠杆菌有显著的抑菌作用，但对霉菌的抑制作用较弱。同时，其他植物来源的黄酮类物质的抗氧化作用均已得到研究证明。陈冰等人[8]研究发现，桑叶黄酮对吉富罗非鱼肌肉具有较好的抗氧化能力，并能改善肌肉氨基酸成分。芮怀瑾等人[9]研究证明，玉米须黄酮作为安全有效的天然抗氧化物质，能较好地抑制冷藏猪肉糜的脂质氧化，维持肉糜品质。

目前，对玉米苞叶中活性物质的研究较少，主要集中在低聚糖和多糖上，对玉米苞叶黄酮的研究较少且很零散，尚无完整、系统的研究[10-12]。为了实现废弃资源的合理利用和开发，减少环境污染，需要加大对玉米苞叶深加工的研发和推广。研究玉米苞叶黄酮的提取工艺，并对其进行纯化，比较和分析其抗氧化活性。通过对玉米苞叶黄酮作为天然抗氧化物质的全面研究，为玉米苞叶深度开发和高附加值产品研制奠定坚实基础，推动加工产业持续健康发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

玉米苞叶，购自徐州市区菜场，经清洗、晾干，粉碎后过40 目筛。

维E、二丁基羟基甲苯（Butylated Hydroxy Toluene，BHT）均为食品级，浙江一诺生物科技有限公司提供；1,1 - 二苯-2- 苦肼基（DPPH，分析纯）、三吡啶三吖嗪（TPTZ，分析纯）、D101 型大孔树脂（分析纯）、芦丁标准品（纯度≥98%），美国Sigma 公司提供；亚硝酸钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、硝酸铝、三氯化铁、醋酸钠、浓硫酸、无水乙醇、95%乙醇均为分析纯，南京化学试剂有限公司提供。

JYL-C012 型九阳料理机，九阳股份有限公司产品；FA1004 型电子天平，常熟市百灵天平仪器有限公司产品；UV-7504 型紫外可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司产品；JP-100S 型恒温超声波振荡仪，深圳市洁盟清洗设备有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮含量的测定

参考方敏等人[13]方法，并作适当修改。以芦丁为标准品，配置质量浓度为0.4 mg/mL 的芦丁标准溶液，分别吸取 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 标准液，分别加入体积分数95%乙醇溶液12 mL 和质量分数5%亚硝酸钠溶液2 mL，静置6 min 后，加入质量分数10%硝酸铝溶液2 mL，静置6 min 后，加入质量分数10%氢氧化钠溶液20 mL，定容至50 mL。静置15 min 后，于波长510 nm 处测定吸光度。以芦丁标准溶液质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程：Y=0.009 5X+0.000 1，R2=0.999 5，线性关系良好。取适量样品，按上述方法操作，测定样品中黄酮含量。

1.2.2 超声波辅助提取法提取条件的确定

超声波辅助法提取玉米苞叶黄酮的主要影响因素包括超声功率、提取时间、提取温度、提取剂乙醇体积分数和料液比，经过前期试验发现，料液比对提取效果影响不显著，因此未将料液比列入正交试验考查范围内，并确定最适料液比为1∶20。

（1）单因素试验。称取干燥至恒质量的玉米苞叶20 g，加入适量体积分数乙醇溶液，在适当超声功率和适当温度下提取适当时间，提取液定容至250 mL，测定提取液中黄酮的吸光度。进行单因素试验考查超声功率的确定值为200，300，400，500，600 W；提取时间的确定值为30，40，50，60，70 min；提取温度的确定值为40，50，60，70，80 ℃；乙醇体积分数的确定值为40%，50%，60%，70%，80%。

（2）正交试验。经过单因素试验得到各因素水平，设计四因素三水平正交试验确定超声波辅助提取法最佳提取条件。

超声波辅助提取法正交试验见表1。

表1 超声波辅助提取法正交试验

根据芦丁标准曲线计算最佳提取条件得到的提取液中黄酮含量，并计算玉米苞叶黄酮得率。得率计算方式如下：

式中：C——样品稀释液中黄酮质量浓度，μg/mL；

V——样液体积，mL；

n——稀释倍数；

m——玉米苞叶质量，g。

1.2.3 玉米苞叶黄酮的纯化

参考徐艳阳等人[14]和王秋实[15]的方法，并作适当修改。取适量玉米苞叶黄酮提取液，上样，静态吸附30 min 后，以蒸馏水洗脱至无色，再用体积分数60%乙醇溶液以1.0 mL/min 流速，洗脱体积5 BV 条件下进行纯化洗脱，收集流出液，测定流出液中黄酮的吸光度，合并收集吸光度最高的纯化液，再经浓缩、冷冻干燥后称质量，并测定其黄酮含量，计算其纯度。

1.2.4 DPPH 自由基清除率的测定

准确称取玉米苞叶黄酮提纯物、维E 和BHT 各0.01 g，溶解并定容至50 mL，得到质量浓度0.2 mg/mL抗氧化物溶液。参考胡喜兰等人[16]的方法，分别测定玉米须黄酮提纯物、维E 和BHT 的DPPH 自由基清除率。DPPH 自由基清除率计算方式如下：

式中：A0——DPPH 溶液2 mL+无水乙醇2 mL 的吸光度；

Ai——DPPH 溶液2 mL+抗氧化物溶液2 mL的吸光度；

Aj——抗氧化物溶液2 mL+无水乙醇2 mL 的吸光度。

1.2.5 铁离子还原能力的测定（FRAP 值法）

参考方敏等人[13]方法，并做适当修改。分别取质量浓度0.2 mg/mL 的玉米苞叶黄酮溶液、维E 溶液和BHT 溶液0.3 mL，预热FRAP 工作液（由浓度为10 mmol/L TPTZ 溶液、浓度为20 mmol/L 三氯化铁溶液、浓度为0.3 mol/L 醋酸钠溶液按照1∶1∶10 配制而成）至37 ℃，移取2.7 mL 与样液混合，摇匀后放置10 min，用无水乙醇作为参比，于波长593 nm处测吸光度，以无水乙醇代替样液加入FRAP 工作液为空白。由测得的吸光值在标准曲线上计算出的相应 FeSO4的浓度（μmol/L）定义为 FRAP 值。

准确量取0.060 8 g 的硫酸亚铁使其被溶于适量的水中，加入浓度为18 mol/L 的硫酸2.5 mL，再加水稀释至500 mL 的定容，即得浓度为800 μmol/L 的FeSO4溶液，按照此法进行稀释，依次进行得到浓度为 12.5，25.0，37.5，50.0，75.0，100.0 μmol/L 的标准溶液，并按照样品FRAP 值的测定步骤进行操作，绘制标准曲线，得到回归方程：Y=0.008 5X，R2=0.999 1，线性关系良好。

1.3 统计分析

每组试验均做3 次。试验数据利用Origin10.0 软件计算方差，差异由Duncan's 多重比较法获得，5%为显著水平。

目前，汽车运用与维修技术专业相关核心课程都是在学校的实训室里，由教师演示过时的教学台架等设备使用，然后由学生自行练习。教师以某项具体操作的熟练度和规范度对学生进行考核，而通过一遍遍的重复练习，学生往往失去学习兴趣。在实训过程中，学生对于汽车维修实际任务的实施并不熟悉，对于岗位要求也不了解，直接导致教师在教学过程中，以理论讲授为主，采用满堂灌的方式进行教学，师生互动少，学生积极性不高。最终学生的理论知识学得不够扎实，实训操作也没得到有效锻炼。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析结果

2.1.1 超声功率对玉米苞叶黄酮提取效果的影响

不同超声功率对玉米苞叶黄酮提取效果的影响见图1。

图1 不同超声功率对玉米苞叶黄酮提取效果的影响

超声波产生的机械效应和空化作用可以帮助细胞破碎，促进玉米苞叶黄酮的溶出，改善提取效果，并且随着超声功率的适当增加，作用越加明显[17]。由图1 可知，随着超声功率从200 W 逐渐增加至400 W，吸光度不断提高，说明提取率不断增加，且呈显著差异（p＜0.05）。超声功率从400～600 W，吸光度没有显著增加，且屡有下降，可能是因为超声功率过大产生的机械力过强，使得黄酮结构遭到破坏，提取效果下降[18-19]。故选择最适超声功率为400 W。

2.1.2 提取时间对玉米苞叶黄酮提取效果的影响

不同提取时间对玉米苞叶黄酮提取效果的影响见图2。

图2 不同提取时间对玉米苞叶黄酮提取效果的影响

由图2 可知，随着提取时间的延长，黄酮不断溶出，在超声功率400 W，提取温度60 ℃，乙醇体积分数60%条件下，测得的吸光度越高，提取时间30～40 min 时吸光度上升幅度大（p＜0.05）；提取时间40～60 min 吸光度趋于平缓，即黄酮溶出逐渐趋于饱和；提取时间至70 min 后，吸光度略有降低，但未形成显著差异（p＞0.05）。可能超声时间过长，机械力增大，破坏了黄酮的结构，并影响其活性[20-21]。为高效提取玉米苞叶黄酮，故选择最适提取时间为40 min。

2.1.3 提取温度对玉米苞叶黄酮提取效果的影响

不同提取温度对玉米苞叶黄酮提取效果的影响见图3。

图3 不同提取温度对玉米苞叶黄酮提取效果的影响

由图3 可知，随着提取温度的升高，反应加剧，黄酮分子与乙醇分子碰撞的几率增加，在超声功率400 W，提取时间50 min，乙醇体积分数60%条件下，随着提取温度越来越高，吸光度越来越大，提取温度40～70 ℃时吸光度持续升高，吸光度变化显著（p＜0.05）；提取温度在70～80 ℃的吸光度趋于稳定，变化不显著（p＞0.05）。另有研究发现，其他植物来源的黄酮类物质在提取过程中由于温度过高存在溶剂汽化损失，黄酮分子结构被破坏，且杂质大量溶出，影响黄酮提取效果的现象[19，22]。为减少能耗和黄酮的损失率，故选择最适提取温度为70 ℃。

2.1.4 乙醇体积分数对玉米苞叶黄酮提取效果的影响

不同乙醇体积分数对玉米苞叶黄酮提取效果的影响见图4。

图4 不同乙醇体积分数对玉米苞叶黄酮提取效果的影响

按照相似相溶原理，提取物与溶剂的极性越接近，提取率越高，不同的乙醇体积分数使得其溶剂极性不同。由图4 可知，在超声功率400 W，提取温度60 ℃，提取时间50 min 条件下，乙醇体积分数40%～60%时吸光度持续增加，呈显著差异（p＜0.05）。乙醇体积分数60%～80%时，吸光度逐渐下降，且乙醇体积分数为80%的测定得到的吸光度显著低于体积分数为60%测得的吸光度（p＜0.05）。这可能是因为乙醇体积分数的增加使得溶剂极性发生改变，加大了多糖、脂溶性物质等其他醇溶性物质的溶出，影响了黄酮的提取效果，故选择最适乙醇体积分数为60%。

2.2 最佳提取条件的正交试验分析结果

超声波辅助提取法正交试验结果见表2。

表2 超声波辅助提取法正交试验结果

由表2 可知，通过极差（R）结果判断出影响超声波辅助提取法对提取液中黄酮吸光度的因素顺序为提取时间＞提取温度＞超声功率＞乙醇体积分数。通过直观分析得到玉米苞叶总黄酮超声波辅助提取的最佳提取条件为A3B2C2D2，而9 组试验中直接找出的最佳提取条件为试验号2，即A1B2C2D2。验证试验结果表明，直观分析的最佳组合A3B2C2D2条件下得到的玉米苞叶的吸光度为0.557，试验号2 组合A1B2C2D2条件下的吸光度为0.489，两者形成显著差异（p＜0.05）。因此，超声波辅助提取法最佳提取条件为超声功率500 W，提取时间40 min，提取温度70 ℃，提取剂乙醇体积分数60%。

经过计算发现，在超声波辅助提取法最佳提取工艺条件下玉米苞叶黄酮得率为1.083%。以该法提取得到的玉米苞叶黄酮为原料进行下一步的纯化和抗氧化试验研究。

2.3 玉米苞叶黄酮的纯化分析结果

纯化前后玉米苞叶黄酮纯度比较见表3。

表3 纯化前后玉米苞叶黄酮纯度比较

将超声波辅助提取法最优条件下得到的玉米苞叶黄酮提取液浓缩、冷冻干燥后得到的干燥物称质量，并测定其黄酮含量，与纯化后得到的纯化物质量及其黄酮含量比较，经D101 型大孔树脂纯化后，玉米苞叶黄酮的纯度提高了1.779 倍。

2.4 玉米苞叶黄酮的抗氧化活性分析结果

2.4.1 玉米苞叶黄酮对DPPH 自由基的清除作用

DPPH 法根据DPPH 自由基带有单电子，波长517 nm 处有强吸收，而抗氧化物质与单电子配对，使强吸收逐渐消失，溶液褪色，故而进行定量测定[9]。根据前期试验研究和其他学者研究的天然植物来源黄酮对DPPH 自由基的半数抑制率（IC5）0，以维E 和BHT 为阳性对照，测定相同质量浓度条件下，玉米苞叶黄酮提纯物对DPPH 自由基的清除率。

玉米苞叶黄酮对DPPH 自由基的清除作用见图5。