番茄木瓜复合益生菌饮料发酵工艺优化及其抗氧化性

王 辉 ，钟海旦 ，白卫东 ，曾晓房 ，杨婉媛

（1. 仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510550；2. 仲恺农业工程学院现代农业工程创新研究院，广东广州 510225；3. 广东佳宝集团有限公司，广东潮州 515638）

根据粮农组织（FAO） 和世界卫生组织（WHO）定义，益生菌是“用量足够时，能给宿主带来健康益处的活性微生物”[1]。益生菌具有维持人体肠道菌群平衡、增强胃肠的蠕动、提高消化和吸收水平、促进微量元素的吸收、加强抵抗力、延缓衰老及抑制腐败微生物生长等多种功能[2]。

番茄，即西红柿，是番茄属的一种一年生或多年生草本植物。番茄含有人体所需的多种维生素和丰富的功能性活性物质，具有良好的抗衰老、抗氧化、降低胆固醇、抗癌等效果，还可以起到预防乳腺癌等多种疾病的辅助作用[3]。木瓜是一种热带水果，在我国华南地区广泛种植，富含蔗糖、还原糖、多种维生素及多种氨基酸、黄酮类等活性物质，具有增强人体免疫力、抗氧化、美容、止泻等作用[4]。

有研究指出，果蔬汁可以作为良好的益生菌发酵基[5]，益生菌发酵果蔬汁不仅可以较好地保留果蔬的营养物质，还兼具益生菌的益生保健功能。近年来，国内外许多学者致力于益生菌发酵果蔬汁的研究。如Mousavi Z E，Ankolekar C，Antunes A E C，Pereira A L F 等人[5-8]将益生菌应用于发酵石榴、苹果、梨；李海萍[9]将乳酸菌接种至蜜柚汁进行发酵；丘裕[10]将植物乳杆菌应用于番茄、胡萝卜复合蔬菜汁中发酵；徐安书等人[11]以德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌为菌种，对龙眼混合果蔬汁进行发酵。

目前，国内外对单一益生菌发酵单一果蔬汁或复合果蔬汁及复合益生菌发酵单一果蔬汁的研究报道较多，但对复合益生菌发酵复合果蔬汁研究报道较少。因此，以复合益菌为菌种，以口感和营养价值俱佳的番茄和木瓜为原料，研制出一款兼具番茄、木瓜风味和乳酸发酵风味的复合益生菌发酵饮料，以满足人们日益增长的消费需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番茄、木瓜，均为市售；双歧杆菌（Bifidobacterium）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum），仲恺农业工程学院轻工食品学院微生物室提供；MRS 肉汤、MRS培养基、平板计数琼脂培养基（PCA），广东环凯微生物科技有限公司提供；没食子酸标准品（95.0%）、芦丁标准品（99.5%），上海瑞永生物科技有限公司提供；邻苯三酚、碳酸钠等，均为分析纯。

722N 型可见光分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；PHS-2F 型pH 计，上海雷磁仪器厂产品；LDZX-50KBS 型高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；BG-270 型隔水式培养箱，上海博迅实业有限公司产品；SW-CJ-1FD 型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄与木瓜益生菌饮料工艺流程

①番茄→清洗→热烫→去皮→切分→榨汁；

②木瓜→清洗→去皮→切分→热烫→榨汁；

①+②混合果汁加入蔗糖调配→灭菌→冷却→接种→发酵→冷藏→成品。

1.2.2 操作要点

（1） 热烫。将番茄和木瓜用90～95 ℃的水热烫2 min。

（2） 榨汁。木瓜与水按料液比3∶1，番茄与水按料液比1.5∶1.0 分别榨汁，过滤。

1.2.3 饮料的感官评价

由15 人组成感官评价小组，对产品进行感官评价，取其平均值作为感官评价结果。

感官评价见表1。

1.2.4 发酵剂的制备

（1） 菌种活化。将菌种接种至10%脱脂乳粉溶液，于37 ℃下发酵4 h，将在4 h 内凝固的酸奶接种至已灭菌的10%脱脂乳粉溶液，传代培养3～4 次，4 ℃下保存。

（2） 菌种驯化。以10%脱脂乳粉溶液与果汁按照9∶1 的配比混合后作为培养基，并逐步降低脱脂乳粉溶液比例至纯混合果汁，接种菌种，培养至乳酸菌含量为1.0×107CFU/mL[12]。

表1 感官评价

1.2.5 番茄汁、木瓜汁和菌种配比的研究

（1） 番茄汁、木瓜汁配比的研究。将番茄汁与木瓜汁分别按 50 ∶50，45 ∶55，40 ∶60，35 ∶65，30∶ 70，25∶75，20∶80，15∶85 比例混合后进行感官评价。

（2） 果汁和菌种配比的研究。在菌种添加量3%和蔗糖添加量6%条件下，将比例为25∶75，30∶70，35∶65 的番茄、木瓜汁，分别采用双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌37 ℃下发酵6 h 后，4 ℃下冷藏20 h。以感官评价为主要评价指标，总酸为辅助指标确定菌种搭配。

（3） 菌种比例的研究。在番茄汁与木瓜汁比例为35∶65，菌种添加量3%的条件下，分别加入比例为2∶1，1∶1，1∶2 的双岐杆菌和植物乳杆菌于37 ℃下发酵6 h，4 ℃下冷藏20 h 后进行感官评价和总酸含量测定。

（4） 发酵工艺单因素试验。番茄汁、木瓜汁混合比例为35∶65，双岐杆菌与植物乳杆菌为2∶1 的条件下，固定接种量为3%，发酵温度为37 ℃，发酵时间为6 h，考查不同蔗糖添加量（3%，4%，5%，6%，7%，8%） 对感官评价和总酸浓度的影响；固定接种量为3%，发酵温度为37 ℃，蔗糖添加量为 6%，考查发酵时间 （4，5，6，7，8，9 h） 对感官评价和总酸浓度的影响；固定发酵温度为37 ℃，蔗糖添加量为6%，发酵时间为6 h，考查接种量（2%，3%，4%，5%，6%，7%） 对感官评价和总酸浓度的影响；固定接种量为5%，蔗糖添加量为6%，发酵时间为6 h，考查发酵温度（35，36，37，38，39， 40 ℃） 对感官评价和总酸浓度的影响。

1.2.6 发酵工艺正交试验优化

以单因素试验为基础进行四因素三水平正交试验。

正交试验因素与水平设计见表2。

表2 正交试验因素与水平设计

1.2.7 产品品质评价

可溶性固形物含量使用阿贝折光仪直接测定；pH值使用pH 计直接测定；还原糖含量参照GB 5009.7—2016 测定；总酸含量参照GB/T 1245—2008 测定；菌落总数参照GB 4789.2—2010 测定；乳酸菌数参照GB 4789.35—2016 测定。

1.2.8 抗氧化物质及活性的测定

黄酮含量测定，采用亚硝酸钠- 硝酸铝分光光度法[13]测定；总酚含量测定，采用福林酚法[14]测定；超氧化物歧化酶（SOD） 活性测定，采用邻苯三酚法[15]测定；维C 含量测定，采用分光光度法[16]测定；羟基自由基清除率测定，采用邻菲咯啉[17]法测定；DPPH 自由基清除率测定，根据李学鹏等人[18]的方法测定。

1.3 数据统计与分析

每个测定均重复3 次，结果表示为平均值±标准偏差。应用SPSS 22.0 软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA） 中的One-Way ANOVA 对所有数据进行方差分析，利用邓肯式多重比较对差异显著性进行分析，p＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 番茄汁、木瓜汁配比和菌种的研究

2.1.1 番茄汁、木瓜汁配比的研究

番茄汁、木瓜汁配比的影响见图1。

图1 番茄汁、木瓜汁配比的影响

由图1 可知，当番茄汁与木瓜汁配比为35∶65，30∶70，25∶75 时，感官评分较高。番茄汁添加量过多时，上清液析出、口感偏酸；木瓜汁添加量过多时，木瓜味过于厚重，果汁过于浓稠，感官评分均较低。因此，选取35∶65，30∶70，25∶75 这3 个配比进行果汁、菌种搭配试验。

2.1.2 番茄汁、木瓜汁与菌种配比的研究

番茄汁、木瓜汁与菌种配比的影响见表3。

由表3 可知，混菌发酵的各项指标明显高于单一菌种（p＜0.05）；混合菌种中，双歧杆菌与植物乳杆菌混合菌种产品的总酸和感官评分最高（p＜0.05）；番茄汁与木瓜汁配比为35∶65 时，总酸浓度和感官评分都较高。分析原因可能是由于单菌发酵产物较单一，而混合乳酸发酵多为异型乳酸发酵，反应产物较为丰富, 口感风味更佳[19]。因此，选取双歧杆菌和植物乳杆菌混合菌种作为发酵菌种，番茄汁与木瓜汁配比确定为35∶65。

表3 番茄汁、木瓜汁与菌种配比的影响

2.1.3 复合益生菌菌种配比的影响

菌种配比的影响见图2。

由图2 可知，当植物乳杆菌配比增加时，总酸逐渐降低。分析原因可能是双歧杆菌和植物乳杆菌都是高产酸菌株，但与双歧杆菌相比，植物乳杆菌产酸能力更强[20-21]。当双歧杆菌与植物乳杆菌配比为2∶1 时，产品的感官评分与总酸浓度均最高。因此，双歧杆菌与植物乳杆菌配比为2∶1 是最佳配比。

图2 菌种配比的影响

2.2 复合益生菌发酵番茄汁、木瓜汁工艺的优化

2.2.1 蔗糖添加量的影响

蔗糖添加量的影响见图3。

图3 蔗糖添加量的影响

由图3 可知，感官评分和总酸浓度均随蔗糖添加量增加呈现先上升后下降的趋势。当蔗糖添加量为2%～6%时，感官评分随蔗糖添加量增加而逐渐上升；当蔗糖添加量为7%时，因为发酵不充分，甜度过高，感官评分降低；蔗糖添加量为6%时，感官评分最高；当蔗糖添加量为4%时，总酸浓度最高。蔗糖添加量大于或小于4%时，总酸浓度偏低。原因是当蔗糖添加量较小时，总酸浓度比较低，碳源不足；蔗糖添加量过大时，微生物受到较高渗透压的影响，生长代谢受到抑制，均导致发酵不充分。以感官评价为主要评价指标，总酸为辅助指标的评价标准，选择蔗糖添加量4%，5%，6%进行正交试验。

2.2.2 发酵时间的影响

发酵时间的影响见图4。

图4 发酵时间的影响

由图4 可知，总酸浓度随发酵时间延长呈现逐渐上升的趋势，感官评分随发酵时间增加呈现先上升后下降的趋势。发酵时间为6 h 时，感官评分最高，可能是因为发酵时间不足6 h 时，产品发酵不完全，导致香味和滋味不够浓郁；发酵时间超过6 h时，总酸浓度过高，导致产品酸味明显增加，感官评分降低。因此，选取发酵时间5，6，7 h 进行正交试验。

2.2.3 接种量的影响

接种量的影响见图5。

图5 接种量的影响

由图5 可知，随着接种量的增加，感官评分先增加后减少，总酸浓度先升高后趋于逐渐稳定。接种量小于5%时，接种量越大，益生菌利用发酸底物产酸速度越快，产酸量越大；接种量达5%后，乳酸菌已充分利用发酵底物产酸，增加接种量对产酸影响变小。接种量为5%时，产品感官评分最高，总酸为2.32 mol/L；接种量大于5%时，感官评分显著降低。因此，选择接种量3%，4%，5%进行正交试验。

2.2.4 发酵温度的影响

发酵温度的影响见图6。

图6 发酵温度的影响

由图6 可知，总酸浓度随发酵温度升高呈现先升高后稳定的趋势，感官评分呈现先升高后下降的趋势。菌种的生长，发酵产酸，风味物质的形成都有不同的最适温度，过低和过高温度对菌种发酵产酸和发酵液的风味和口感会产生影响。发酵温度过低时，菌种的生长和繁殖速度较慢，果汁未充分发酵，产酸和风味物质均不足；发酵温度过高时，发酵速度高，但产生的风味不佳。当发酵温度为37 ℃时，发酵产品感官评分和总酸浓度最高。因此，选择发酵温度37，38，39 ℃进行正交试验。

2.2.5 正交试验结果与分析

发酵工艺正交试验结果见表4。

由表4 可知，最优发酵工艺组合为A2B3C1D2，即蔗糖添加量6%，菌种接种量5%，发酵温度37 ℃，发酵时间6 h。经检测，该工艺条件下发酵的番茄汁、木瓜汁益生菌饮料的pH 值为3.73，总酸浓度为 2.3 mol/L，菌落总数为7.1×103CFU/mL，乳酸菌数为 5.7×108CFU/mL，均符合 T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素规定》[22]，且酸甜适中，组织状态均匀，具有果蔬特有风味。

2.3 发酵前后果汁抗氧化物质及活性的变化

表4 发酵工艺正交试验结果

果汁抗氧化质物及活性的变化见表5。

表5 果汁抗氧化质物及活性的变化

由表5 可知，发酵后，番茄、木瓜益生菌饮料中的SOD 酶活性、总酚含量、黄酮含量均显著提高（p＜0.05），分别比发酵前增加了28.28%，21.50%，33.01%。但维C 含量由发酵前的43.77 μg/mL 降至发酵后的30.79 μg/mL。可能是因为维C 不稳定，在发酵过程中极易被氧化和维C 在发酵过程中被乳酸菌作为碳源所利用[23]。同时，发酵后对羟基自由基和DPPH 自由基的清除率均显著提高（p＜0.05），DPPH自由基清除率达到了93.49%。可能是乳酸菌发酵后产生一些糖苷酶去除基化酚类化合物，使抗氧化性增强[24-26]；还可能产品本身含有的多酚、维C、SOD等起到一定的协同作用，从而使产品在发酵后抗氧化性显著增强。

3 结论

（1） 以番茄和木瓜为原料，确定了复配果汁接种复合益生菌菌种的最佳发酵工艺为番茄汁、木瓜汁混合配比35∶65，双歧杆菌和植物乳杆菌混合配比2∶1，接种量5%，蔗糖添加量6%，发酵温度37 ℃。按照该工艺所制得的番茄、木瓜益生菌饮料为橙色，色泽明亮、酸甜适中，具有果蔬特有风味。其可溶性固形物、还原糖含量、pH 值、总酸、菌落总数、乳酸菌数均符合T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素规定》。

（2） 与发酵前相比，发酵后番茄、木瓜益生菌饮料中的SOD 酶活性、总酚和黄酮的含量分别提高28.28%，21.50%和33.01%，维C 含量降低29.70%；同时，抗氧化能力较大程度提高，羟基自由基清除率提高41.50%，DPPH 自由基清除率提高11.35%。