应用TLC-CMS-IR 技术检测北芪菇中黄芪甲苷

杨卫民，杜京旗，刘 猛，赖静茹，刘慧敏

（吕梁林果植物化学省市共建山西省重点实验室培育基地；山西省特色植物功能成分工程研究中心，吕梁学院，山西吕梁 033001）

正北芪，又称恒山黄芪，地理标志为“浑源正北芪”。中国著名药物学家李时珍在《本草纲目》中把“正北芪”列为上品，为中国北芪之正宗。正北芪富含蔗糖、葡萄糖、淀粉、黏液质、叶酸、甜茶碱、胆碱、树胶、纤维素及多种氨基酸，具有泻阴火、益正气、壮脾胃、去肌热、排脓止痛、活血医疮等功能。北芪菇的命名是依据中医药学“药食同源”的记载，将正北芪、多种中草药、农作物副产品作培养料，采用科学的配方和特殊的工艺培育而成的新型菌类产品，故命名为“北芪菇”[1-2]。经过山西省医药研究所化验检测和权威专家进行鉴定，发现北芪菇中含有多种人体所需的微量元素、维生素、矿物质，是一种食用菌。长期食用北芪菇可以充分补充人体所需的一些营养物质，是人们健康实用的美味佳品。分析化验显示，北芪菇的营养价值是任何动物食品、植物食品不能比拟的。其高蛋白、低脂肪、矿质元素（硫、铁、钾、硒）、维生素（硫胺素、核黄素、烟酸）等都是人体良好的营养源。其代谢产物具有极高的药用价值，有抗肿瘤的多糖蛋白，有抗菌作用的抗生素，有降低血压、防治脑血管障碍的微量牛黄酸，还有有利于胃肠作用的菌糖、甘露糖和帮助消化的各种酶等。特别是北芪菇内含有特殊功能的高倍量硒化物多糖，是普通蘑菇所不具有的。北芪菇可以治疗牛皮癣，早在1992、1993 年光明日报就对此作了2 次详细的报道[3-4]。

黄芪甲苷是环阿尔廷型三萜皂苷类化合物，是中药黄芪中的有效成分之一，其含量的高低是评价黄芪质量好坏的主要标准。其植物来源是来自于豆科亚历山大黄芪（Astragalus alexandrinus Boiss）的根，深裂黄芪（Astragalus dissectus）的根，膜荚黄芪（Astr-agalus membranaceus（Fisch.）Bungede）的根，绵毛黄芪（Astragalus sieversianus Pall.）的根，多刺黄芪（Astragalus spinosus Vahl）地上部分[5]。黄芪甲苷不仅具有黄芪多糖的作用，还有许多是黄芪多糖无法比拟的作用，其药效强度是常规黄芪多糖的2 倍多，抗病毒作用更是黄芪多糖的30 倍。由于含量少、效果好，更是有“超级黄芪多糖”之称。主要具有增强机体免疫力、提高机体的抗病能力、抗病毒作用、抗应激功效和作为促生长剂的作用，此外黄芪甲苷还具有改善心肺的功能[6-11]。

有关北芪菇的化学成分研究方法有多种，大致有超滤法、高速离心法，水提取法、回流法、超声提取法、水提醇法，甲醇提取法、酸性乙醇提取法、乙醇提取法、乙醚提取法等。最好的黄芪甲苷的提取方法是乙醇提取法，这种提取方法可以将甲苷的提取率增值到最大[12-19]。至今有关运用TLC- CMS 联用测定北芪菇中的黄芪甲苷还没有，以北芪菇作为原料，利用薄层色谱法制备提取生物活性物质，采用质谱、红外对其进行表征与分析。应用Plate ExpressTM 技术可直接从TLC 薄层板上获取质谱图，其优点是不经过样品前处理，可快速从复杂混合物中获得目标物分子质量信息，并对其进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北芪菇和黄芪，山西省浑源县恒山北芪菇专业合作社提供。

乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇、无水乙醇、石油醚、浓硫酸（均为分析纯）；色谱甲醇，美国Fisher 提供；硅胶高效 G 板；黄芪甲苷 （CAS:84687-42-3），上海麦克林生化科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

ALB-224 型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；XH-300B 型微波-超声波组合合成/萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司产品；KH-3000Plus 型薄层色谱仪，上海科哲生化科技有限公司产品；Expressions 型质谱仪，Plate ExpressTLS-型质谱接口，美国Advion 公司产品；Tensor-11 型傅里叶红外光谱仪，德国布鲁克公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 北芪菇中黄芪甲苷的提取

将北芪菇和正北芪干燥粉碎，过80 目筛，取10 g 置于70%乙醇250 mL 溶液中振荡，于50 ℃下浸提24 h。

超声波微波萃取仪分3 个阶段提取，每阶段5 min，共15 min。在超声波恒定的条件下，设置温度为45，50，55 ℃；超声功率为800，900，1 000 W；微波功率为250，300，350 W；超声频率为50 kHz，模式15∶10，电机转速900 r/min。

将提取液以转速4 000 r/min 离心10 min，3 次，合并上清液、过滤、浓缩至体积的1/10。

石油醚去杂后，用饱和正丁醇萃取3 次[20-21]，合并上层溶液、浓缩至无液体溢出时用甲醇（色谱纯）将其定容至10 mL。备用。

标准品的制备：称取黄芪甲苷20 mg 标准品置于10 mL 容量瓶中，用色谱甲醇定容，超声条件下溶解后分别得到2 mg/mL 的黄芪皂苷Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ标准品，置于2～4 ℃的冰箱中保存。备用。

1.3.2 薄层色谱技术分离与制备

（1）点样。用微量进样器缓慢吸取25 μL 黄芪甲苷对照品溶液，置于全自动点样机上，设置点样参数（点样间距10 mm，点样宽度8 mm，点样数目4，点样量分别为 2，4，6 μL，点样速度 5 s/μL），在聚酰胺薄层板上进行点样，在吸取25 μL 供试品溶液，点样20 μL。

（2）展开。在层析缸中配制北芪菇和黄芪的展开剂，分别为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水= 13∶7∶2∶2 和氯仿∶甲醇∶水= 13∶7∶2，盖上盖子摇晃混匀，静置20 min，将已点样的薄层板放入展开缸内，待距薄层板顶端约1 cm 处时，取出晾干，于通风口处，并喷10%硫酸乙醇显色剂在105 ℃下高温显色。

（3）成像。将显色后的层析板放入薄层色谱成像系统，于波长365 nm 处紫外光灯下拍照观察层析情况，并拍照记录。

1.3.3 质谱和红外质谱检测方法

（1）质谱检测方法。用色谱甲醇和超纯水作为流动相。将仪器和软件打开使其处于工作状态，用微量进样器吸取10 μL 的黄芪甲苷标准品溶液插入到进样口处，打到Load 档开始进样，进完样后打回到Inject 档。点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

（2）待测液的质谱检测。流动相与测标准品的流动相相同。使仪器和软件处于工作状态，将待测品薄层板置于TLC-质谱接口上，使激光对准圈出的硒代蛋氨酸斑点中心处。用软件操作进行取样，点开谱图界面对谱图进行分析并保存。

待测样品质谱检测方法与黄芪甲苷标准品的质谱检测方法相同。

（3）红外检测方法。打开仪器选择相应的工作界面，用擦镜纸擦干净点样中心处，测试背景，再用毛细管吸取少量的黄芪甲苷标准品于点样中心处，测试样品，对谱图界面出现的谱图进行处理和分析。待测样品的制备与待测样品的质谱检测方法相同；待测样品的红外检测方法与黄芪甲苷标准品的检测相同。

注：待测样品溶液是指与黄芪甲苷标准品Rf 值相同的样品斑点。

1.3.4 熔点仪/旋光仪进行物理表征检测

用甲醇对旋光仪进行校正后，然后将待测溶液（用于质谱检测的样液）倒入，调节模式，测定黄芪甲苷的旋光度和比旋光度，记录其数值及平均值。将待测溶液蒸发结晶后测定其熔点。

2 结果与分析

2.1 薄层图像比对分析

北芪菇样品与黄芪甲苷标准品的TLC 成像图见图1，正北芪样品与黄芪甲苷标准瓶的TLC 成像图见图2。

图1 北芪菇样品与黄芪甲苷标准品的TLC 成像图

图2 正北芪样品与黄芪甲苷标准瓶的TLC 成像图

由图1 可知，最佳展开剂为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水= 13∶7∶2∶2（V/V），展开后，与黄芪甲苷标准品荧光斑点位置一致的荧光斑点为北芪菇中的黄芪甲苷，Rf 值为0.31。

由图2 可知，最佳展开剂为氯仿∶甲醇∶水=13∶7∶∶2（V/V），展开后，与黄芪甲苷标准品荧光斑点位置一致的荧光斑点为正北芪中的黄芪甲苷，Rf 值为 0.31。

黄芪甲苷的结构式见图3。

图3 黄芪甲苷的结构式

2.2 质谱波谱分析

2.2.1 黄芪甲苷结构及理化性质

黄芪甲苷为环阿尔廷型三萜皂苷类化合物，白色至淡黄色粉末，mp29510～29610e；CAS 编号：83207-58-3，分子式：C41H68O14，分子量：784.970 2；白色至淡黄色粉末，熔点295.0～296.0 ℃；易溶于甲醇、乙醇、丙酮，难溶于氯仿、乙酸乙酯等弱极性有机溶剂。

2.2.2 黄芪甲苷质谱波谱分析

黄芪甲苷标准品的质谱波谱图见图4，北芪菇中黄芪甲苷的质谱波谱图见图5，正北芪中黄芪甲苷的质谱波谱图见图6。

图4 黄芪甲苷标准品的质谱波谱图

通过查阅相关文献[20]可以得知，分子离子峰的识别首先是该离子峰范围内最大的峰值（m/z），其次需要判断该物质是否符合氮律，不含N 或含偶数N的有机分子，其分子离子峰的质荷比（即分子量）为偶数。含奇数N 的有机分子，其分子离子峰的质荷比（即分子量）为奇数，这两点是识别离子峰的关键。黄芪甲苷的分子量为784.97，分子式为C41H68O14，结构式中不含N。从图4、图5 和图6 可以观察到，三者离子峰范围内的最大峰值均为807.6，与黄芪甲苷的分子量相差约23，表示该物质在电子的轰击下增加了一个Na 离子[M+Na+=807.97]，为合理性的增加，由此可以确定黄芪甲苷的离子峰为807.6。

图5 北芪菇中黄芪甲苷的质谱波谱图

图6 正北芪中黄芪甲苷的质谱波谱图

2.3 黄芪甲苷的红外图谱分析

黄芪甲苷标准品的红外图谱见图7，北芪菇中黄芪甲苷的红外波谱图见图8，正北芪中黄芪甲苷的红外波谱图见图9。

图7 黄芪甲苷标准品的红外图谱

通过查阅文献[21]与分析图7、图8 和图9，可以看到三者在1 600～1 700 cm-1有相似的峰，说明都含有苯环；在3 000～3 200 cm-1三者有相似的峰，说明都含有羟基；在2 900～3 000 cm-1有相似的峰，说明都含有-C-H 单键；在1 380 cm-1附近有相似的峰，说明都含有-CH3键；在1 000～1 500 cm-1有相似的峰，说明都含有C-O 单键；在700～1 000 cm-1之间有相似的峰，说明=C-H 弯曲振动吸收峰在三者中都具有，这些峰值基本符合黄芪甲苷结构的特征峰。

图8 北芪菇中黄芪甲苷的红外波谱图

图9 正北芪中黄芪甲苷的红外波谱图

结合质谱波谱特征，由此可以确定所测样品是黄芪甲苷。

2.4 样品熔点、旋光度和比旋光度分析

北芪菇中黄芪甲苷的熔点见表1。

表1 北芪菇中黄芪甲苷的熔点/℃

由表1 可知，北芪菇样品与黄芪甲苷标准品熔点均为295 ℃，在熔点295.0～296.0 ℃内，而且易溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂。

北芪菇中黄芪甲苷的旋光度与比旋光度见表2。

表2 北芪菇中黄芪甲苷的旋光度与比旋光度

相关文献记载，黄芪甲苷的旋光度：-56.6（c,0.13 in DMF），与北芪菇所测样品基本一致。

3 结论

以恒山北芪菇为原料，乙醇-水（7∶3（V/V））为提取剂。微波超声波萃取仪分3 个阶段提取，每阶段5 min，共15 min。在超声波恒定的条件下，设置温度为45，50，55 ℃，超声功率为800，900，1 000 W，微波功率为250，300，350 W，超声频率为50 kHz，模式15∶10，电机转速900 r/min。经多级萃取后获得黄芪皂苷的正丁醇相。以氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=13∶7∶2∶2（V/V）为展开剂，薄层层析获得的黄芪甲苷样品荧光斑点显色清晰，与黄芪甲苷标准品比对荧光斑点位置一致，其Rf 值为0.31。

质谱图谱显示，黄芪所测样品的质荷比与黄芪甲苷标准品基本保持一致，质荷比均为807.6，与黄芪甲苷的分子量相差约23，表示该物质在电子的轰击下增加了一个Na 离子[M+Na+=807.97]，为合理性的增加。红外谱图显示，黄芪所测样品所含官能团与黄芪甲苷标准品基本相同。

北芪菇样品与黄芪甲苷标准品熔点均为295 ℃，在熔点295.0～296.0 ℃内，而且易溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂。黄芪甲苷的旋光度：-56.6（c,0.13 in DMF），与北芪菇所测样品基本一致。

黄芪甲苷应用在医学上可以治疗牛皮藓、增强机体免疫力、提高机体的抗病能力，还有抗病毒作用和抗应激功效；作为促生长剂、黄芪甲苷可改善心肺功能等[22-24]。然而，研究发现不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件，具有较强的适应性，为从复杂的天然产物粗制品中提取不同特性的有效成分提供了有利条件。

TLC-MS-IR 联用在北芪菇生物活性物质分离纯化中具有操作简便、容易掌握、回收率高、重现性好、分离效率高、分离量较大等特点，该技术有望在标准品的制备、天然产物化学成分研究及新药筛选、评价、分析或质控需求等领域得到更广泛的应用。