益心泰对心肌缺血再灌注损伤大鼠JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响

2021-03-17孙涛郭志华李雅龙云曾英王月

中国中医药信息杂志 2021年2期

孙涛，郭志华，李雅，龙云，曾英，王月

孙涛1，郭志华2，李雅2，龙云1，曾英1，王月1

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南长沙 410208

观察益心泰对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）大鼠JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响，探讨其保护心肌的作用机制。采用结扎冠状动脉前降支法建立MIRI大鼠模型。实验大鼠随机分为假手术组、模型组和益心泰低、中、高剂量组。TTC染色检测心肌梗死面积，TUNEL法检测细胞凋亡，ELISA检测白细胞介素（IL）-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、LC3、Beclin 1、p62、JAK2、p-JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白表达。与假手术组比较，模型组大鼠肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）表达明显升高（＜0.01）；心肌梗死面积显著增加（＜0.01）；TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高（＜0.01）；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin 1蛋白表达明显升高（＜0.01），p62蛋白表达明显降低（＜0.01）；Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表达升高，细胞凋亡率明显上升（＜0.01）；p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT显著降低（＜0.01）。与模型组比较，益心泰各剂量组大鼠CK-MB及cTnⅠ表达明显降低（＜0.01）；心肌梗死面积显著减少（＜0.01）；TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低（＜0.01）；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin 1蛋白表达明显降低（＜0.01），p62蛋白表达明显升高（＜0.01）；Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白表达降低，细胞凋亡率明显降低（＜0.01）；p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT显著升高（＜0.01）。JAK2特异性抑制剂AG490可逆转益心泰对MIRI大鼠JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达、心肌损伤标记物、细胞凋亡、自噬及炎症反应的影响。益心泰可通过激活JAK2/STAT3信号通路减轻MIRI大鼠炎症反应、抑制细胞凋亡及过度自噬，从而保护心脏。

益心泰；缺血再灌注损伤；细胞凋亡；细胞自噬；炎症因子；JAK2/STAT3信号通路；大鼠

随着人们生活方式的改变，我国缺血性心脏病发病率逐年上升，心脏急性缺血事件致死率居高不下，目前优选的治疗方案是开通闭塞血管，恢复血流再灌注，常用方式包括经皮冠状动脉介入、冠状动脉搭桥术和溶栓，但在再灌注过程中心肌组织均会受到损伤，即心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia- reperfusion injury，MIRI），情况严重时可能造成患者死亡。因此，急需寻找一种方法保护心脏，最大程度地减少MIRI[1]。多项研究表明，中药在减少MIRI方面具有肯定疗效，如黄芪、红花、南葶苈子等[2-4]。上述药物是益心泰的主要成分，益心泰在临床治疗心脏疾病20余年，安全性良好，且疗效已得到验证[5-6]。本课题组前期研究表明，益心泰能通过抑制G蛋白偶联受体和炎症因子表达有效干预心肌梗死大鼠预后[7]，但其对MIRI是否有保护作用尚无实验阐释。本研究旨在通过JAK2/STAT3信号通路探索益心泰对MIRI的保护作用及其分子机制，为今后研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性健康SD大鼠120只，清洁级，体质量200～230 g，湖南省人民医院动物中心提供，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南中医药大学实验动物中心，室温22～24 ℃，相对湿度52%～60%，光/暗周期12 h/12 h，自由摄食饮水，通风，分笼饲养，饲料及水均由该中心提供。

1.2 药物、试剂与仪器

益心泰由湖南中医药大学第一附属医院中成药制剂中心提供，全方由黄芪、红花、丹参、泽泻、猪苓、葶苈子按3∶1∶1∶2∶1∶1比例制备，批号20181102；JAK2特异性抑制剂AG490（美国Sigma，货号SIH-428-25MG）；肌酸激酶同工酶（CK-MB，货号E4606-100）和心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ，货号PRO-345）检测试剂盒（默沙克公司），白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA检测试剂盒（默沙克公司，货号分别为PAB16919、583311-96、K4754-100）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（湖南玉堂春生物公司，货号KTA2010）；兔抗大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3、LC3、Beclin 1、p62、β-actin抗体（英国Abcam公司）。

1.3 分组、造模和给药

将实验大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和益心泰低、中、高剂量组，每组12只。采用冠状动脉前降支结扎法复制大鼠MIRI模型[8]：大鼠腹腔注射2%异氟烷麻醉，仰卧位固定，气管插管，连接微型人工呼吸机，正压通气。于左侧第4肋间打开胸腔，剥开心包，暴露心脏。在左心耳根部与肺动脉圆锥间用6-0丝线穿过，将冠状动脉左前降支（LAD）暂时结扎。以心电图Ⅱ导联ST段抬高≥0.1 mV或T波高耸、心肌变暗红色为结扎成功标志。阻断大鼠前降支血流30 min，恢复血供再灌注24 h。假手术组大鼠除不结扎LAD外，余手术步骤均相同。益心泰各剂量组根据成人体表面积换算法，按低（2.1 g/kg）、中（4.2 g/kg）、高（8.4 g/kg）剂量灌胃给药，假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，给药体积均为10 mL，每日1次，连续7 d。为分析JAK2/STAT3信号通路在益心泰干预MIRI大鼠中作用，用AG490（1 mg/mL）单独并与高剂量益心泰10 mL同时灌胃MIRI大鼠。

1.4 指标检测

1.4.1 心肌损伤标记物

采集大鼠颈动脉血，室温放置30 min，3000 r/min离心15 min，收集血清。按照试剂盒说明书检测血清CK-MB和cTnⅠ含量。

1.4.2 心肌梗死面积

大鼠处死后摘取心脏，将心脏垂直于心脏长轴切开，切成3 mm切片。使用TTC染色，温育、静置24 h后用数码相机拍摄图像，检测梗死区域面积。染色后非梗死区心肌呈深红色，梗死区心肌呈淡白色。使用Image J软件测量心肌梗死区域面积与心肌切片总面积的比值，用百分比表示。

1.4.3 细胞凋亡

取出心脏，挤干血液，冲洗干净后取部分心肌组织，固定、脱水、包埋后，常规切片，厚度4 μm，用TUNEL法检测，荧光显微镜（×200）下拍照，凋亡小体呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光，计算细胞凋亡指数。细胞凋亡指数（%）＝凋亡细胞÷细胞总数×100%。每组动物切5张片，每张取5个高倍视野统计凋亡细胞数，取平均值。

结合图9、图10可以得到，方铅矿具有较好浮选回收率的矿浆电位区间与元素硫存在的电位-pH区间大致重合，这是因为在此区间内生成的元素硫具有良好的疏水性，从而提高了方铅矿浮选回收率。当矿浆电位过低时，溶液具有强还原性，此时硫元素会被还原成亲水性的两性离子HS-，使矿物疏水性减弱，回收率降低。当矿浆电位过高时，溶液呈强氧化性，会生成PbO，形成亲水钝化层[8]，同样会影响方铅矿浮选，使回收率降低。

1.5 JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达检测

取大鼠心肌组织，采用Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3、LC3、Beclin 1及p62蛋白的表达，用GE AI600多功能成像仪扫描条带，并用Gel-Pro Analyzer 4.0软件对结果进行分析。

1.6 炎症因子含量检测

收集小鼠血清，按照ELISA试剂盒说明书进行检测。将样品加入反应孔，37 ℃孵育45 min，用洗涤液洗涤4次，加入生物素标记的抗体，37 ℃孵育30 min，洗涤后加链霉亲和素-HRP，混匀，37 ℃孵育30 min，加入显色剂避光显色15 min，再加终止液终止反应，于波长450 nm处检测IL-6、IL-1β和TNF-α吸光度。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 益心泰对模型大鼠心肌损伤标志物及梗死面积的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织CK-MB及cTnⅠ水平明显升高，心肌梗死面积明显增加，差异均有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，益心泰低、中、高剂量组大鼠心肌组织CK-MB及cTnⅠ水平明显降低，心肌梗死面积明显减少（＜0.01），且各指标均呈剂量依赖关系，见图1。TTC染色结果显示，假手术组大鼠心肌组织纤维排列整齐，无纤维结构改变；模型组大鼠心肌组织纤维紊乱，出现肌丝溶解、空泡变性等病理变化；益心泰中、高剂量组大鼠心肌组织病理变化较模型组明显改善。见图2。

注：A.假手术组；B.模型组；C.益心泰低剂量组；D.益心泰中剂量组；E.益心泰高剂量组；与A比较，**P＜0.01；与B比较，##P＜0.01

图2 各组大鼠心肌组织形态（TTC染色，×400）

2.2 益心泰对模型大鼠心肌组织细胞凋亡的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织细胞凋亡率显著增加（＜0.01）；与模型组比较，益心泰各剂量组大鼠心肌组织细胞凋亡率明显降低（＜0.01）。见图3。与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Bax表达升高，Bcl-2表达降低，Bax/Bcl-2比值、Caspase-3明显升高（＜0.01）；与模型组比较，益心泰各剂量组大鼠心肌组织Bax表达降低，Bcl-2表达升高，Bax/Bcl-2比值、Caspase-3明显降低（＜0.01），且各指标均呈剂量依赖关系。见图4。

注：A.假手术组；B.模型组；C.益心泰低剂量组；D.益心泰中剂量组；E.益心泰高剂量组；与A比较，**P＜0.01；与B比较，##P＜0.01

2.3 益心泰对模型大鼠心肌细胞自噬的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达明显升高（＜0.01），p62蛋白表达明显降低（＜0.01）；与模型组比较，益心泰各剂量组大鼠心肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达明显降低，p62蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（＜0.01），且各指标均呈剂量依赖关系。见图5。

2.4 益心泰对模型大鼠心肌炎症因子水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌IL-6、IL-1β和TNF-α含量明显增加（＜0.01）；与模型组比较，益心泰各剂量组大鼠心肌IL-6、IL-1β和TNF-α含量明显减少（＜0.01）。见图6。

2.5 益心泰对模型大鼠JAK2/STAT3信号通路的影响

注：A.假手术组；B.模型组；C.益心泰低剂量组；D.益心泰中剂量组；E.益心泰高剂量组；与A比较，**P＜0.01；与B比较，##P＜0.01

2.6 JAK2特异性抑制剂联合益心泰对心肌缺血再灌注损伤大鼠的影响

为进一步证实益心泰通过JAK2/STAT3信号通路发挥对MIRI大鼠保护作用，用JAK2特异性抑制剂AG490单独及和益心泰同时干预MIRI大鼠。AG490可逆转益心泰对MIRI大鼠JAK2/STAT3信号通路相关蛋白的磷酸化、心肌损伤标记物、炎症因子、细胞凋亡及自噬相关蛋白的影响。见图8～图12。

注：B.模型组；E.益心泰高剂量组；F. AG490组；G. AG490＋益心泰高剂量组；与B比较，**P＜0.01；与E比较，##P＜0.01

注：B.模型组；E.益心泰高剂量组；F. AG490组；G. AG490＋益心泰高剂量组；与B比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与E比较，##P＜0.01

注：B.模型组；E.益心泰高剂量组；F. AG490组；G. AG490＋益心泰高剂量组；与B比较，**P＜0.01；与E比较，##P＜0.01

注：B.模型组；E.益心泰高剂量组；F. AG490组；G. AG490+益心泰高剂量组；与B比较，**P＜0.01；与E比较，##P＜0.01

注：B.模型组；E.益心泰高剂量组；F. AG490组；G. AG490＋益心泰高剂量组；与B比较，**P＜0.01；与E比较，##P＜0.01

3 讨论

MIRI因其多发性和不可避免性受到越来越多的关注。MIRI对手术效果和疾病转归都有直接的影响。MIRI是在多因素共同作用下发生的，机制十分复杂，迄今仍未完全明了。目前研究表明，细胞自噬、细胞凋亡及炎症反应均与MIRI关系密切[9]。

凋亡是受多因素调控的程序化细胞死亡，其中Bcl-2家族蛋白是凋亡的核心因素，目前发现的Bcl-2成员有22种，它们是一组同源或异源二聚体，按照其在凋亡过程中所起的不同作用，可分为以Bcl-2及Bcl-w为代表的抗凋亡蛋白，和以Bax及Bak为代表的促凋亡蛋白。细胞的生存与否，取决于其中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的比例。研究显示，MIRI过程中，促凋亡蛋白Bax、Bak等可被激活和上调，并促进心肌细胞凋亡[10-11]。有研究显示，敲除大鼠Bax基因可有效缓解MIRI、抑制心肌细胞凋亡、缩小心肌梗死面积，起到心肌保护作用[12]。Bcl-2蛋白的高表达可使转基因大鼠心肌细胞凋亡量明显下降[13]。此外，Caspase是细胞凋亡程序的又一个关键因素，根据其功能差异，Caspase家族蛋白分为启动型和执行型。Caspase蛋白在一般状态下均以前体形式存在于细胞中，在上游凋亡信号的刺激下才能启动，先激活启动型蛋白，继而激活执行型蛋白，在活化的执行型Caspase蛋白的作用下，裂解特异性底物，最终导致细胞凋亡。Caspase-3为执行型蛋白，是整个凋亡过程的直接执行者，直接反映凋亡程度[14-15]。本研究结果表明，益心泰可抑制MIRI大鼠细胞凋亡，减少Bax、Caspase-3蛋白表达，增加Bcl-2蛋白表达。

炎症反应普遍存在于机体各组织器官的病理生理过程中，MIRI也不例外，在MIRI过程中最直接的表现是炎症因子水平升高，其主要已知机制是白细胞对心肌缺血组织的病理浸润，同时诱导心肌细胞释放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子，同步加重心肌损害[16]。IL-1是炎症反应启动因子，同时激发机体防御反应[17]。研究发现，MIRI后抑制IL-1β的表达可缓解炎症反应，减少心肌梗死面积。IL-6是反映MIRI炎症程度的关键指标，IL-6表达升高会加剧炎症反应[18]。TNF-α在炎症反应中的主要功能是促进炎性介质释放，从不同途径加剧炎症反应，TNF-α表达处于低水平时，能有效增加机体免疫力，而过多的表达则会改变细胞膜通透性，引发组织损伤[17]。有研究表明，受损心肌细胞中TNF-α含量明显增加[19]。本研究显示，益心泰可下调MIRI大鼠心肌细胞炎症因子的表达，从而达到保护心肌的效果。

酪氨酸激酶Janus家族中有多个成员，其功能多样，转录因子STAT是其明确的下游因子，JAK2/STAT3信号通路在心肌细胞中作用最明显，是一条重要的通路，也是研究最为深入的通路之一[20]。JAK2/STAT3信号通路作用十分丰富，对氧化应激及细胞自噬、增殖、凋亡、炎症反应等发挥重要作用。JAK2与STAT3蛋白一般情况下都处于细胞质中，其被应激信号刺激后，会激活磷酸化，继而转入细胞核，结合下游不同靶因子，发挥多种生物学效应。因此，当p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3比值增加时，认为JAK2/STAT3信号通路被激活[21]，激活的JAK2/STAT3信号通路对心肌细胞有着明确的保护作用。有研究表明，激活的JAK2/STAT3信号通路可增加抗凋亡蛋白的表达，减少促凋亡蛋白的表达，缩小心肌梗死面积，改善心功能[22]。研究显示，JAK2/STAT3信号通路是介导炎症反应的经典途径，通过对下游靶点的调控，可使诸多炎症因子如核因子-κB、IL-1β及TNF-α等表达增加[23-25]。研究发现，小鼠MIRI模型及乳鼠心肌细胞H/R模型中发现，糖基化产物可通过STAT3途径抑制模型动物心肌自噬过度激活，从而保护心肌[26-27]。本研究结果表明，益心泰对MIRI大鼠JAK2/STAT3信号通路有明确的激活作用。因此，JAK2/STAT3信号通路可能是MIRI大鼠心肌细胞自噬、凋亡及相关炎症反应的共同上游靶点。在予AG490干预MIRI大鼠后，益心泰对心肌细胞的保护作用被逆转，进一步证实益心泰是通过JAK2/STAT3信号通路调控MIRI大鼠心肌细胞的炎症反应、细胞凋亡及过度自噬。

综上所述，益心泰可通过激活JAK2/STAT3信号通路减轻MIRI大鼠炎症反应、抑制细胞凋亡及过度自噬，从而保护心脏。

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Effects ofon JAK2/STAT3 Signaling Pathway Protein Expression in Rats with Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury

SUN Tao1, GUO Zhihua2, LI Ya2, LONG Yun1, ZENG Ying1, WANG Yue1

To observe the effects ofon JAK2/STAT3 signaling pathway protein expression in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI）; To explore its myocardial protective mechanism.A rat model of MIRI was established by ligating the anterior descending coronary artery. Experimental rats were randomly divided into sham-operation group, model group andlow-, medium- and high-dosage groups. TTC staining was used to detect the area of myocardial infarction; TUNEL method was used to detect cell apoptosis; ELISA was used to detect the levels of IL-6, IL-1β and TNF-α. Western blot was used to detect Bax, Bcl-2, Caspase-3, LC3, Beclin 1, p62, JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 protein levels.Compared with the sham-operation group, the expressions of CK-MB and cTnⅠ in the model group increased significantly (<0.01); the area of myocardial infarction increased significantly (<0.01); the levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β increased significantly (<0.01); expressions of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and Beclin 1 increased significantly (<0.01), and expression of p62 decreased significantly (<0.01); expressions of Bax/Bcl-2 and Caspase-3 protein increased, and apoptosis rate increased significantly (<0.01); p-JAK2/JAK2, p-STAT3/STAT significantly decreased (<0.01). Compared with the model group, expressions of CK-MB and cTnⅠ ingroups decreased significantly (<0.01); myocardial infarction area was significantly reduced (<0.01); levels of TNF-α, IL-6, IL-1β were significantly reduced (<0.01); expressionsof LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and Beclin 1 protein decreased significantly (<0.01), and expression of p62 increased significantly (<0.01); expressions of Bax/Bcl-2 and Caspase-3 decreased, and the apoptosis rate decreased significantly (<0.01 ); p-JAK2/JAK2, p-STAT3/STAT increased significantly (<0.01). The JAK2-specific inhibitor AG490 could reverse the effects ofon the expressions of JAK2/STAT3 signaling pathway-related proteins, markers of myocardial injury, apoptosis, autophagy, and inflammation in rats with MIRI.can alleviate MIRI in rats by activating JAK2/STAT3 signaling pathway, inhibit cell apoptosis and excessive autophagy, thereby protecting the heart.

; ischemia-reperfusion injury; apoptosis; autophagy; inflammatory factor; JAK2/STAT3 signaling pathway; rats

R285.5

1005-5304(2021)02-0054-08

10.19879/j.cnki.1005-5304.202006405