基于网络药理学的左金丸治疗肝癌机制探讨

2021-03-17莫嘉浩许洪彬李菁李金生綦向军钟崇

中国中医药信息杂志 2021年2期

莫嘉浩，许洪彬，李菁，李金生，綦向军，钟崇

基于网络药理学的左金丸治疗肝癌机制探讨

莫嘉浩1，许洪彬1，李菁2，李金生3，綦向军4，钟崇5

1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510405；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007；3.广州中医药大学第三临床医学院，广东广州 510405；4.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；5.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405

运用网络药理学研究左金丸治疗原发性肝癌的作用机制。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）获取左金丸的化合物及靶点，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为阈值进行化合物筛选，将靶点输入Uniprot获取靶点对应的基因Symbol；从人类基因数据库（GeneCards：The Human Gene Database）获取原发性肝癌的疾病基因，并筛选出与左金丸靶点基因的交集基因；运用Cytoscape3.7.1软件绘制活性成分-靶点、疾病-中药-化合物-交集靶点（基因）网络图；运用String构建蛋白相互作用网络，运用g:Profiler数据分析平台进行GO富集及KEGG通路富集分析；联合主要化合物、交集基因与通路分析结果，绘制成分-靶点-通路网络图。筛选得到左金丸化合物41种、交集基因111个，剔除不含交集基因（靶点）的化学成分后得到化合物31种，槲皮素、黄连素、吴茱萸碱等为左金丸的主要活性成分，AKT1、TP53、HSP90AA1等为主要作用靶点。GO富集分析共获得条目136条，涉及细胞因子受体结合、核受体结合、调控序列特异性DNA结合等多个生物过程，KEGG富集分析得到165条通路。左金丸通过多靶点调控PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎通路、IL-17信号通路等治疗原发性肝癌。经生物信息学的基因芯片验证，结果基本相符。

左金丸；原发性肝癌；网络药理学；信号通路

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）指发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤[1]，全球病死率居恶性肿瘤第三位[2]。2015年报道，我国肝癌发病率为466.1/10万，病死率为422.1/10万[3]。因其具有发病隐匿、进展迅速、复发快、预后差等特点[4]，故防治是临床研究重点。

左金丸出自《丹溪心法》，由黄连、吴茱萸组成，主要用于肝火犯胃之呕吐、胁痛等。药理学研究表明，其水煎液可通过阻断AP-1等通路有效抑制肝癌细胞HepG2的增殖，也可通过诱导线粒体凋亡以抗癌[5-6]。有miRNA网络机制研究发现，黄连、吴茱萸的主要有效成分黄连素与吴茱萸碱联用具有抗癌作用[7]。目前虽已确认黄连素和吴茱萸碱分别为黄连、吴茱萸的抗肿瘤活性成分[8]，但中药成分复杂，靶点众多，尚需进一步分析。现有研究认为，左金丸作用靶点可能涉及癌症、肝病、代谢、炎症等，与癌症尤为相关[8]，但针对特定疾病的网络药理学研究仍欠缺。本研究运用网络药理学的多成分、多靶点、多通路分析方法，全面阐释左金丸治疗肝癌的机制。

1 资料与方法

1.1 左金丸化合物与靶点获取

运用中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php）分别查找黄连、吴茱萸，获取相应的化合物。以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18为条件进行化合物筛选，以提高数据的真实可靠性[10-13]。运用TCMSP查找所得化合物对应的靶点信息，将结果输入Uniprot（http://www.uniprot.org/），获取靶点对应的基因Symbol。

1.2 肝癌疾病基因获取

以“hepatocellular carcinomas”“liver cancer”“hepatoma”“hepatic cancer”“hepatic carcinoma”为关键词，从人类基因数据库（GeneCards：The Human Gene Database，https://www.genecards.org/）获取肝癌的疾病基因，与左金丸的靶点基因对比后筛选出二者的交集基因。GeneCards数据库集合已得到实验验证、组学检测验证的基因与疾病关系信息，具有全面性、权威性，并通过GIFtS算法对基因-疾病的相关度进行排序[14]，其Relevance score有助于从特定疾病对应的诸多靶点中筛选出相关度更高的靶点[15]。设置Relevance score≥10，提取高关联度靶点基因。

1.3 活性成分-靶点、疾病-中药-化合物-交集靶点（基因）网络构建

获取交集基因后，对化合物进行反向筛选，剔除靶点基因中不含交集基因的化合物，运用Cytoscape3.7.1软件绘制活性成分-靶点、疾病-中药-化合物-交集靶点（基因）网络图，并采用该软件的network analyzer模块进行网络拓扑学分析。

1.4 蛋白相互作用网络构建

将所得交集基因输入String数据分析平台（https://string-db.org/）进行蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）网络分析，分析模式设定为“Multiple proteins”，物种限定为“Homo sapiens”。对数据进行预读后，设置置信度≥0.99，并隐藏孤立蛋白，最后输出PPI网络图。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

运用g:Profiler数据分析平台（https://biit.cs.ut.ee/ gprofiler/gost）进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，将物种限定为“Homo sapiens”，采用g:SCS算法进行值的校正。g:SCS算法是g:Profile团队开发的用于计算GO和KEGG富集分析所得值的多重测试校正方法，与Bonferroni及False Discovery Rate等校正方法相比，该算法考虑到每个生物体术语注释下的潜在基因集合结构，提供了一个更为严谨的阈值[7]，筛选校正后＜0.05的富集结果。运用Excel2010进行数据可视化，R软件绘制靶点-通路干预机制图。

1.6 成分-靶点-通路网络

结合主要成分、核心靶点与KEGG分析所得通路，运用Cytoscape3.7.1软件绘制成分-靶点-通路网络图，分析其整体关联。

1.7 肝癌基因样本获取

为进一步验证基因的准确性，以“hepatocellular carcinomas”“liver cancer”“hepatoma”“hepatic cancer”为关键词，检索美国国立生物技术信息中心（NCBI）的GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），筛选有关人类肝癌基因的实验数据。然后使用R软件（3.6.1）中的affy软件包（1.62.0），将mRNA的原始数据转换成可识别格式，通过Robust-Multi-Array（RMA）方法进行背景矫正和标准化处理，最终得到标准化后的表达值矩阵，用于后续的差异表达分析。

1.8 筛选并验证差异表达基因

利用R软件中limma函数包筛选肝癌样品中的差异表达mRNAs。筛选阈值为＜0.05和|log2FC|＞0.5，绘制火山图，并在样品中进行差异表达mRNAs的双向聚类分析。将差异基因与左金丸基因取交集，再与研究结果的肝癌-左金丸交集基因结果对比，验证准确性。

2 结果

2.1 左金丸化学成分及靶点

以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，共获得左金丸活性成分44种，其中黄连14种、吴茱萸30种，去除重复成分后共41种。转换后得到靶点基因黄连287个、吴茱萸330个，去除重复后得到靶点基因187个。从GeneCards数据库获得肝癌疾病基因共8567种，高关联度靶点基因1196个。对疾病靶点和左金丸靶点经人工校对后取交集，获得基因111个，剔除不含交集基因（靶点）的化学成分，得到相关化学成分31种，其中黄连7种、吴茱萸22种，二者共有成分2种，见表1。

2.2 可视化网络构建

2.2.1 活性成分-靶点网络

采用Cytoscape3.7.1软件对左金丸中具有靶点的化合物及其对应靶点构建可视化网络，结果见图1。该网络共142个点，包括化合物31个、靶点基因111个，其相互作用用连线表示。利用Cytoscape软件Network Analyzer插件中的Visualize Parameters对网络进行处理，节点大小代表Degree的大小，边的粗细代表Edge Betweenness的大小。其中5个靶点基因Degree＞20，提示这些靶点基因可能在左金丸中起主要药效作用。

2.2.2 疾病-中药-化合物-交集靶点网络

采用Cytoscape3.7.1软件绘制左金丸治疗肝癌疾病-中药-化合物-交集靶点（基因）网络，结果见图2。

注：黄色代表化合物，紫色代表靶点基因

注：绿色代表交集基因，黄色代表化合物；左下方为Degree＜3的集合，右下方为Degree≥3的集合

2.3 蛋白相互作用网络

将左金丸治疗肝癌的靶点基因导入String11.0数据库进行分析，PPI网络见图3。62个蛋白存在85条相互作用关系。将PPI网络导入Cytoscape3.7.1软件并利用cytoHubba插件分析网络中基因的重要性，排名前20位的关键基因见表2。

表2 左金丸治疗肝癌的关键基因（前20位）

2.4 GO功能富集分析

GO功能富集分析共获得符合筛选标准的条目136条，对富集基因数前20位的条目进行可视化，以条形的长度代表相应条目所富集基因数，结果见图4。

2.5 KEGG通路富集分析

对左金丸治疗肝癌的111个基因进行KEGG通路富集分析，值排序前10位的通路见表3，前20位通路富集气泡图见图5。此外，对KEGG结果进行预读后发现，与肝癌密切相关的通路有PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路，运用R软件加载Bioconductor包对PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎通路、IL-17信号通路进行靶点-通路机制分析，以红色标记代表左金丸可能进行干预的潜在靶点，结果见图6～图8。

表3 左金丸治疗肝癌基因KEGG通路富集（前10位）

图4 左金丸治疗肝癌基因GO功能富集条形图（前20位）

图5 左金丸治疗肝癌基因KEGG通路富集气泡图（前20位）

图6 左金丸治疗肝癌乙型肝炎通路分析

图7 左金丸治疗肝癌IL-17信号通路分析

图8 左金丸治疗肝癌PI3K-Akt信号通路分析

2.6 成分-靶点-通路网络

通过文献检索与阅读，在前20位的KEGG通路中筛选出可能与肝癌相关的通路，并将其与左金丸的活性成分、作用靶点结合，构建成分-靶点-通路多维网络，结果见图9。

注：黄色代表药物，蓝色代表与肝癌相关的活性成分，绿色代表潜在靶点，紫色代表与肝癌相关通路

2.7 肝癌基因样本

符合条件的基因表达数据集为GSE54238，包括10个正常样本和13个肝癌样本，检测平台为GPL16955（Arraystar human lncRNA microarray V1-100309）。

2.8 差异表达基因验证

筛选后得到差异表达的mRNAs共2382个，其中表达上调1182个，表达下调1200个，组间差异火山图见图10。差异基因与左金丸基因取交集后得到29个交集基因，与“2.1”项下交集基因对比，共18个基因重叠，包括AKT1、AR、CCNA2、CCNB1、CDK2、CTSD、CYP3A4、E2F1、EGFR、FOS、HSP90AA1、KDR、NR1I2、ODC1、PON1、RXRA、STAT1、TP53。经对比验证，该18个基因为左金丸-肝癌关键基因，亦位于前述PPI网络图中核心位置。

图10 肝癌差异表达mRNA火山图

3 讨论

左金丸有泻肝火、开痞结之功，其中黄连燥湿泻火解毒，吴茱萸温中散寒止痛，二者相配，寒热并用，辛开苦降，使肝火得清，胃气得降，湿邪得化。

本研究借助TCMSP平台，筛选得到左金丸活性成分41种，药物靶点基因187个；将其对应的靶点与肝癌的疾病靶点进行对比，获得交集基因111个，筛选得到潜在化合物31种，其中部分化合物的有效性及作用机制已被证实。黄连、吴茱萸均富含檞皮素和黄连素。槲皮素是一种强大的自由基清除剂，能抑制人体内肝癌细胞株SMMC-7721的增殖[16]，国外研究发现其可调节TP53以抑制肝癌细胞增殖[17]，与本研究PPI网络所得关键基因靶点结果一致。黄连素主要通过AMP-活化蛋白激酶促进肝癌细胞凋亡[18]，一项关于黄连素干预肝癌细胞的研究显示，黄连素可通过上调葡萄糖调节蛋白78（GRP78）选择性促进肝癌细胞自噬性死亡，并发现AFT6很可能是黄连素的新靶点[19]。黄连中OB值最高的化合物巴马汀可通过抑制细胞凋亡和调节细胞因子反应以减轻小鼠肝损伤程度[20]，体外实验也证实其具有抗癌活性[21]。吴茱萸中OB值最高的吴茱萸碱可通过促进肿瘤坏死因子（TNF-α）的生成和调节细胞周期变化而发挥抗癌作用[22]，TNF是Degree≥3的重要基因靶点之一。吴茱萸主要活性成分吴茱萸碱、吴茱萸次碱、羟基吴茱萸碱等均属于生物碱类化合物，具有抗肿瘤作用[23]。上述化合物多数具有较高的度值，位于左金丸治疗肝癌疾病-中药-化合物-交集靶点（基因）网络的核心，提示这些化合物对应的靶点基因可能在左金丸抗肝癌过程中起主要作用。

活性成分与交集靶点基因PPI网络可确定核心治疗靶点。AKT1、TP53、CDKN1A、HSP90AA1等是左金丸治疗肝癌的核心靶点。AKT是PI3K-Akt信号通路的重要桥梁点[24]，而PI3K-Akt信号通路被越来越多的研究证明在肝癌的发生和发展中起关键作用[25-27]，也是本研究KEGG通路富集结果中计数最多的通路。有研究显示，TP53突变在HBV感染导致的肝癌中有重要意义[28]，其HBV致癌通路也是本研究的KEGG通路富集结果之一。CDKN1A编码一种蛋白依赖性的激酶抑制剂，编码的蛋白可阻滞细胞周期于G1期，CDKN1A表达受抑癌蛋白p53的严格控制，有研究发现其可联合端粒酶以抑制肿瘤增殖[29]。HSP90AA1居于PPI网络中心区域，有研究发现其在中重度抑郁组肝癌患者中呈现高表达[30]，且与肝癌患者的肿瘤临床分期存在一定相关性[31]。

本研究经PPI网络确定核心靶点后，进行GO功能富集分析以探讨其具体的功能作用，结果主要集中在细胞因子受体结合、核受体结合、调控序列特异性DNA结合等过程。此外，泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding，adj＝3.68×10-9）、血红素结合（heme binding，adj＝4.55×10-9）等亦为重要的生物过程，参与抑制癌细胞增殖，预防肝脏癌细胞转移进展[32-33]。

本研究通过KEGG通路富集分析追踪左金丸治疗肝癌的代谢通路，并作成分-靶点-通路网络分析整体联系。结果发现，左金丸主要作用于PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎通路、IL-17信号通路、丙型肝炎通路。PI3K-Akt信号通路参与细胞的生长、存活、增殖、凋亡等过程，对多种癌症具有重要的调控作用[34]，其以AKT靶点为枢纽，抑制PI3K-Akt信号通路中AKT表达，从而抑制肝癌细胞迁移和侵袭[35]，而AKT在左金丸治疗肝癌PPI网络中有重要地位。在乙型肝炎通路图中可见左金丸对其中的肝癌侵袭转移通路（HCC invasion and metastasis）、肝癌发展通路（HCC development）等进行调节，靶点基本占据通路的重要节点。IL-17是一种与固有性及适应性免疫应答相关的细胞因子，IL-17升高与肝癌的发生、发展呈正相关[36]，动物实验表明IL-17可通过拮抗γ-干扰素促进肝癌细胞的生长[37]。左金丸治疗肝癌IL-17信号通路图中，左金丸的作用靶点基本覆盖IL-17通路各段，可见，IL-17的调节与肝癌的发生发展有密切联系，有助于验证相关临床研究[37]。成分-靶点-通路网络图显示，槲皮素（MOL000098，quercetin）的化合物-药物、化合物-靶点关联度最高，与潜在核心化合物挖掘结果相符，可进一步证实其为左金丸治疗肝癌的核心活性成分。

综上所述，本研究通过网络药理学分析结合文献发现，槲皮素、黄连素、吴茱萸碱为左金丸的主要活性成分，经基因芯片验证，核心靶点以AKT1、TP53、HSP90AA1等为主，涉及细胞因子受体结合、核受体结合、调控序列特异性DNA结合等多个生物过程，并通过调控PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎通路、IL-17信号通路发挥抗癌作用。本研究对阐明左金丸治疗肝癌及预防其转移的作用机制具有借鉴意义，但结论仍待进一步实验和临床研究验证。

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Discussion on Mechanism ofPills in Treatment of Hepatocellular Carcinoma Based on Network Pharmacology

MO Jiahao1, XU Hongbin1, LI Jing2, LI Jinsheng3, QI Xiangjun4, ZHONG Chong5

To study the mechanism ofPills in the treatment of hepatocellular carcinoma based on network pharmacology.The compounds and targets ofPills were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). The compounds were screened by oral bioavailability (OB) ≥30% and drug-like (DL) ≥0.18 as thresholds, and the targets were input into Uniprot to obtain the gene Symbol. The disease target genes of hepatocellular carcinoma were obtained from GeneCards: The Human Gene Database, and intersection genes of target genes ofPills were screened. Cytoscape3.7.1 software was used to draw network diagrams of active ingredient-target and disease-TCM-compound-intersection target (gene). The protein-protein interaction relationship network was constructed by String. GO enrichment and KEGG pathway enrichment were analyzed by g:Profiler data analysis platform. Combined with the analysis resultsof major compounds, intersection genes and pathways, the component-target-pathway network diagram was drawn.Totally 41 compounds and 111 intersection genes ofPills were obtained and chemical components without intersection genes (targets) were removed, and 31 compounds were finally screened. Quercetin, berberine, evodia rutaecarpa alkali were the main active ingredients ofPills, and AKT1, TP53, HSP90AA1 were the main targets. After GO enrichment analysis, a total of 136 items meeting the screening criteria were obtained, involving multiple biological processes such as cytokines involved in receptor, nuclear receptors, regulatory sequence specific DNA binding, and 165 were obtained by KEGG enrichment analysis.Pills can control PI3K-Akt signal pathway, hepatitis B, and IL-17 signal pathway to treat hepatocellular carcinoma. The results are basically consistent through bioinformatics gene chip verification.

Pills; hepatocellular carcinoma; network pharmacology; pathway

R273.57；R285.5

1005-5304(2021)02-0019-09

10.19879/j.cnki.1005-5304.202001256