和厚朴酚对大鼠肝纤维化及P38MAPK/Nrf2信号通路的影响*

符 健 高 艺 林 锋 李海林

1海南省人民医院感染科 (海南 海口， 570311) 2.海南医学院基础医学与生命科学学院

肝纤维化是由多种致病因子导致肝脏结缔组织异常增生的病理性变化[1]。P38MAPK/Nrf2信号通路是介导细胞凋亡及炎症反应的信号转导通路，其能够通过调节体内炎症因子及氧化应激损伤，进而参与肝纤维化的病理过程[2，3]。和厚朴酚是从传统中药材厚朴中提取的化合物，具有抗炎、抗氧化应激损伤及免疫调节等多种药理作用[4]。然而，和厚朴酚对于肝纤维化大鼠P38MAPK/Nrf2信号通路的调节作用目前尚未见明确报道。笔者首次研究和厚朴酚对肝纤维化大鼠P38MAPK/Nrf2信号通路的影响，探讨和厚朴酚抗大鼠肝纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级成年雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量(180±20)g，购于海南医学院实验动物中心，动物房温度(22±2)℃，湿度(50±10)%，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 药品及试剂 和厚朴酚购自南京道斯夫生物科技有限公司；HA、LN、PCⅢ、CⅣ酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；TNF-α、IL-6及IL-1β ELISA检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒、MDA检测试剂盒、P38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2及GAPDH抗体购自碧云天生物科技有限公司。

1.3 主要仪器及设备 ECLIPSETS100-F型倒置显微镜购自日本 Nikon 公司；MRZ14M010型高速冷冻离心机购自美国Beckman公司；SpectraMax190型多功能酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司；ChemiDoc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；BX50/BX-FLA/DP70型光学/荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.4 模型建立及分组 除正常组15只大鼠外，其余60只大鼠参照文献方法[5]建立四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型，方法为：每只大鼠按照3 ml/kg的剂量首次腹腔注射CCl4，之后按照3 ml/kg腹腔注射体积分数为50%的CCl4-橄榄油溶液(橄榄油∶CCl4=1∶1)，2次/周，连续给药8周后，随机抽取3只大鼠，以戊巴比妥溶液麻醉后断颈处死，迅速分离肝组织，采用苏木精-伊红染色，观察大鼠肝组织病理情况，以评价造模是否成功。正常组大鼠腹腔注射等量橄榄油。将造模完成后的大鼠按照随机数字表法分为模型组(15只)、HNK低、中、高剂量组(各14只，简称低、中、高剂量组)，低、中、高剂量组大鼠按体重20 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg的剂量腹腔注射HNK；正常组及模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水，均1次/d，连续给药28 d，各组大鼠最后一次给药24 h后，进行后续实验。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 检测血清肝功能指标 每组取6只大鼠，通过眼眶后静脉丛取血至干净离心管中，于4℃静置4 h后置于离心机中4℃，3 500 rpm离心10 min，取上清液，用全自动生化分析仪测定大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平。

1.5.2 测定血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平 大鼠眼眶后静脉丛取血至干净离心管中，采用上述方法处理，按照ELISA 试剂盒说明书检测大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.5.3 测定血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平 每组取6只大鼠以10%水合氯醛进行麻醉后取仰卧位，腹主动脉取血至干净离心管中，按上述方法处理，采用ELISA试剂盒说明书分别检测大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平。

1.5.4 测定肝组织SOD活性及MDA水平 颈椎脱臼处死大鼠后，取大鼠肝组织，用4℃预冷的生理盐水洗去表面血液后，用滤纸吸干表面水分，按照试剂盒说明书检测大鼠肝组织SOD活性及MDA水平。

1.5.5 观察肝组织病理学变化 大鼠处死后取肝组织，在10%甲醛中固定24 h后转移至75%的酒精中，经脱水、透明处理，石蜡包埋，进行5 μm切片，水浴，捞片，沥干，放恒温箱中烘干，置于烘箱中烤2 h，常规苏木精-伊红染色(HE染色)，在显微镜下观察肝组织病理学情况。

1.5.6 检测肝组织P38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2蛋白水平 取大鼠肝组织放入玻璃匀浆器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解，置于4℃离心机以12 000 rpm离心10 min，用移液枪将上清液移至另一干净离心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混匀后放入100℃水浴5 min，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1 h，经P38MAPK、p-P38MAPK、Nrf2及GAPDH抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，应用Image J软件进行免疫印迹灰度值检测及定量分析。

2 结果

2.1 各组大鼠血清肝功能指标测定结果 见表1。

表1 各组大鼠血清肝功能指标结果比较

2.2 各组大鼠血清肝纤维化指标测定结果 见表2。

表2 各组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平比较

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平测定结果 见表3。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较

2.4 各组大鼠肝组织SOD、MDA水平测定结果 见表4。

表4 各组大鼠肝组织SOD活性及MDA水平比较

2.5 各组大鼠肝组织P38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2蛋白水平测定结果 见图1。

图1 各组大鼠肝组织p38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2蛋白表达图与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

2.6 各组大鼠肝组织P38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2蛋白电泳情况 见图2。

图2 各组大鼠肝组织蛋白电泳图

2.7 各组大鼠肝组织病理学检查结果 见图3。与对照组相比，模型组大鼠肝组织细胞结构被破坏，细胞变性融合，边界不清，并可见大量炎性细胞浸润，肝门静脉周围明显纤维化，可见胆管扩张，肝组织内脂肪空泡形成；与模型组相比，HNK低、中、高剂量组大鼠肝组织病理明显改善，HNK低剂量组大鼠肝细胞变性及炎性细胞浸润明显减轻，肝门静脉纤维化有所改善，HNK中、高剂量组大鼠肝组织细胞明显恢复正常，脂肪空泡明显减少，偶见肝组织细胞炎性浸润，肝组织纤维化明显减轻。

A:正常组；B:模型组；C:低剂量组；D:中剂量组；E:高剂量组图3 各组大鼠肝组织病理图(HE，×200)

3 讨论

肝纤维化是指肝损伤导致的静止态肝组织星状细胞激活，释放大量以平滑肌肌动蛋白和胶原蛋白为主的细胞外基质堆积的病理过程，在一定程度上，肝纤维化是机体进行肝脏损伤自我修复的生理过程，但如果长期不能去除肝损伤的各种诱因，则会发展为不可逆性肝纤维化，进而进展为肝硬化、肝癌等[1]。目前临床上对肝纤维化的治疗主要采用去除炎症因子及减轻脂质过氧化反应等手段[6]，然而，目前可供临床选择的药物种类有限，其治疗有效率也并不理想。

MAPK信号通路是参与细胞凋亡及炎症因子信号传递的重要细胞信号通路，并由一组可被细胞外炎症因子、激素、细胞毒物质、细胞应激反应等激活的蛋白激酶组成，P38MAPK则是该组蛋白激酶的重要成员之一。研究表明P38MAPK起着调节组织细胞炎症反应及抗炎症反应的重要作用，且P38MAPK可随着肝纤维化的疾病进展而表达增加，同时，P38MAPK的过度激活则又能够加速肝纤维化的病理进展[7-9]。Nrf2是机体组织细胞抗炎症反应等生理过程的主要靶点之一，其能够通过抑制炎症因子的释放，缓解氧化应激损伤而发挥作用。在正常组织细胞中，Nrf2与其抑制蛋白Keap1形成复合物而失活；而在氧化应激等刺激下，Nrf2 迅速与Keap1解离后激活，并发生核转移进入到细胞核，启动下游相关基因的转录，发挥抗氧化作用，促进肝细胞再生，减轻肝脏损伤、抑制肝纤维增生[2，3]。

和厚朴酚是从木兰科落叶乔木植物厚朴的干皮、根皮及枝皮中提取的单体化合物。现代药理研究表明，和厚朴酚具有保护神经、抗心肌缺血再灌注损伤及动脉粥样硬化等多种药理作用[10]。谭志鑫[11]、刘长海等[12]均报道了和厚朴酚对CCl4诱导的小鼠肝损伤具有一定的防护作用，夏西超等[13]研究表明和厚朴酚能够提高小鼠肝组织抗氧化能力，减轻小鼠肝损伤。本实验结果提示和厚朴酚能够显著减轻肝纤维化大鼠肝细胞损伤，恢复肝功能、提高肝组织SOD活性，显著降低肝纤维化大鼠体内炎症因子水平及氧化应激损伤、促进肝脏损伤因子的去除及肝组织细胞的恢复，使肝组织病理明显改善。究其机制可能与其抑制P38MAPK的过度表达，并激活调节P38MAPK/Nrf2信号通路有关。