白芥子穴位贴敷抑制肝癌H22移植性肿瘤生长的实验研究*

王双双 郑国银 卿照前

1.长沙市中医医院(长沙市第八医院)内科 (湖南 长沙， 410100) 2.上海长海医院中医肿瘤科

近些年，中医中药在肝癌治疗中的作用越来越受到关注。穴位贴敷是临床常用的中医治疗手段，将药物贴敷于特定穴位，通过药物与穴位的共同作用来调整经络脏腑功能，达到治疗疾病的目标。肝俞穴、灵台穴、中都穴是治疗肝脏疾病的常用穴位，有动物实验表明，使用治癌灵对上述3个穴位进行贴敷治疗能够抑制肝癌H22移植瘤的生长[1]。白芥子是十字花科植物白芥的干燥成熟种子，有研究报道白芥子挥发油具有抗肝癌活性[2]，但会产生较严重的毒副作用，而白芥子是否能够通过穴位贴敷的给药方式发挥治疗肝癌的作用尚不明确。

白芥子涂法穴位贴敷最早见于清代医家张璐的《张氏医通》，国内李宁的动物实验发现，白芥子涂法穴位贴敷能够在过敏性哮喘豚鼠中发挥气道保护作用，同时能够激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径中的细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)及p38[3]。在肝癌的发病过程中，ERK1/2通路及p38通路均存在异常表达[4，5]，但能够调控ERK1/2及p38的白芥子涂法穴位贴敷是否具有抗肝癌作用尚不明确。本实验分析了白芥子穴位贴敷通过MAPK途径抑制移植瘤生长的作用及机制，旨在为发现肝癌新的治疗手段提供思路。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞 肝癌H22细胞株购自ATCC公司。BALB/C雄性小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，生产许可SCXK(沪)2019-0002。

1.2 药品与试剂 白芥子组方由医院药剂科制备，阴性对照腺病毒(Ad-NC)、过表达ERK1/2的腺病毒(Ad-ERK1/2)购自上海吉玛公司、滴度1×109PFU/ml；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL显影试剂盒购自上海碧云天公司，ERK1/2、p38、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK一抗购自CST公司，细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、c-myc、波形蛋白、E-钙黏蛋白一抗购自Abcam公司。

1.3 仪器 细胞培养箱为Thermo公司，中药粉碎机为山东经欣粉体设备科技公司，电泳系统及凝胶成像系统为上海天能公司。

1.4 方法

1.4.1 白芥子药膏制备 白芥子、延胡索、甘遂、细辛在中药粉碎机中粉碎后过100目筛，按照2∶2∶1∶1的比例混合并过80目筛3次，药物粉末与姜汁等体积混合后得到药膏，每10 g药膏内加入0.1 g麝香并混匀，分装在15 ml离心管中，密封后放置在-20℃冰箱备用。

1.4.2 肝癌H22移植瘤小鼠模型建立 H22细胞接种在小鼠腹腔内，6～8 d后形成腹水，处死小鼠并抽取腹水，用生理盐水稀释并制备成1×107/ ml的细胞悬液，在小鼠右前肢腋下给予0.2 ml细胞悬液皮下注射，1周后形成米粒大小的瘤块判断为造模成功。

1.4.3 小鼠分组及给药 造模成功后，肝癌H22移植瘤小鼠随机分为对照组、白芥子组、白芥子+Ad-NC组、白芥子+Ad-ERK1/2组，每组各6只。对照组小鼠不进行特殊处理。白芥子组小鼠选择移植瘤部位、肝俞穴、灵台穴、中都穴进行穴位贴敷，取0.05 g白芥子药膏放置在3 M透明敷料上，制成直径3 mm的贴膏，贴于相应的部位，隔日换药1次，共4次。白芥子+Ad-NC组、白芥子+Ad-ERK1/2组小鼠按照白芥子组相同的方法进行白芥子穴位贴敷，在首次穴位贴敷前在瘤体分别进行多点注射Ad-NG、ERK1/2，共5点，每点注射4 μl。

1.4.4 小鼠一般状态及移植瘤重量的观察 造模成功后，每日观察小鼠的精神状况、活动情况，穴位贴敷干预前1 d及每次穴位贴敷干预后(即干预第1天、第3天、第5天、第7天)时均进行称重；末次穴位贴敷干预后48 h，处死小鼠，完整解剖移植瘤并称重。

1.4.5 蛋白表达的western blot检测 取移植瘤，加入RIPA裂解液后匀浆，采用BCA试剂盒检测匀浆液中的蛋白含量，取30 μg蛋白样本进行western blot检测，将蛋白样本与上样缓冲液混合，加入SDS-聚丙烯氨酰胺凝胶，电泳分离蛋白，而后电转移至PVDF膜，将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中、室温封闭1 h。将PVDF膜放入1∶1 000稀释的p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、ERK1/2、p38、JNK、cyclinD1、c-myc、波形蛋白、E-钙黏蛋白一抗或1∶5 000稀释的β-actin一抗中、4℃孵育过夜，将PVDF膜放入1∶2 000稀释的二抗中、室温孵育1 h，最后加入ECL显影液并在凝胶成像仪中曝光，根据蛋白条带的灰度值，分别以ERK1/2、p38、JNK为内参计算p-ERK1/2、p-p38、p-JNK的表达水平。以β-actin为内参，分别计算目的基因cyclinD1、c-myc、波形蛋白、E-钙黏蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值，即为目的基因的表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0软件录入数据，4组间计量资料的比较采用方差分析、两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠一般状态 干预期间，4组小鼠精神状况良好、活动正常，均未出现死亡。干预前及干预第1天、第3天、第5天、第7天时，4组小鼠体质量比较，均差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 4组小鼠体质量比较

2.2 4组小鼠移植瘤重量 与对照组比较，白芥子组小鼠移植瘤的重量明显减轻(P<0.05)；与白芥子组比较，白芥子+Ad-NC组小鼠移植瘤的重量无显著差异(P>0.05)，白芥子+Ad-ERK1/2组小鼠移植瘤的重量明显增加(P<0.05)。见图1。

图1 4组小鼠移植瘤重量比较

2.3 4组小鼠移植瘤中MAPK信号通路 与对照组比较，白芥子组小鼠移植瘤中p-ERK1/2的表达水平明显降低(P<0.05)，p-p38、p-JNK的表达水平无显著差异(P>0.05)；与白芥子组比较，白芥子+Ad-NC组小鼠移植瘤中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK的表达水平无显著差异(P>0.05)，白芥子+Ad-ERK1/2组小鼠移植瘤中p-ERK1/2的表达水平明显增加(P<0.05)，p-p38、p-JNK的表达水平无显著差异(P>0.05)。见图2、表2。

图2 4组小鼠移植瘤中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、ERK1/2、p38、JNK的表达水平

表2 4组小鼠移植瘤中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK表达水平比较

2.4 4组小鼠移植瘤中ERK1/2下游增殖相关基因表达 与对照组比较，白芥子组小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc的表达水平明显降低(P<0.05)；与白芥子组比较，白芥子+Ad-NC组小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc的表达水平无显著差异(P>0.05)，白芥子+Ad-ERK1/2组小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc的表达水平明显增加(P<0.05)。见图3、表3。

图3 4组小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc的表达水平

表3 4组小鼠移植瘤中cyclinD1、c-myc表达水平比较

2.5 4组小鼠移植瘤中ERK1/2下游侵袭相关基因表达 见图4、表4。

图4 4组小鼠移植瘤中波形蛋白、E-钙黏蛋白的表达水平

表4 4组小鼠移植瘤中波形蛋白、E-钙黏蛋白表达水平比较

3 讨论

白芥子是十字花科植物白芥的干燥成熟种子，新近的研究证实该药物在多种肝脏疾病的治疗中发挥一定作用。根据Cao S及陈涛的研究，白芥子能够抑制肝纤维化[6，7]；根据吴圣曦等[2]的研究，白芥子挥发油能够抑制肝癌H22移植瘤的生长，但白芥子挥发油在发挥抗肝癌作用的同时也存在明显的毒副作用，移植瘤小鼠在治疗过程中出现了脱毛、呕吐、体重减轻、免疫抑制等情况。以上结果提示，白芥子可能在肝癌的治疗中具有一定价值，但白芥子挥发油腹腔注射给药的方式会产生较大的毒副作用，需要寻找其他给药途径。

穴位贴敷是临床上常用的中医治疗手段，肝癌发病的中医病机包括瘀、毒、虚3个方面[8]，贴敷时，可选择肝俞、灵台、中都3个穴位。肝俞穴是五脏六腑之精气输注在体表的部位；灵台穴是足厥阴肝经郄穴，能疏肝理气；中都穴是督脉经穴，能清热解毒[9，10]。本实验将白芥子穴位贴敷用于肝癌H22移植瘤小鼠的治疗，参照吴金苗等的研究选择了肝俞、灵台、中都3个穴位进行贴敷，结果发现白芥子组小鼠的移植瘤重量明显减轻，表明白芥子穴位贴敷能够显著抑制肝癌H22移植瘤的生长。

在初步明确白芥子穴位贴敷能够抑制肝癌移植瘤生长的作用后，本研究还对介导这一作用的分子机制进行了探究。多项肝癌相关的研究表明，MAPK途径中的ERK1/2、p38、JNK均肝癌组织中异常表达，多种抗癌药通过调控MAPK途径抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭[11，12]。白芥子穴位贴敷能够激活MAPK途径中的ERK1/2和p38两条通路[3]。白芥子组小鼠移植瘤中p-ERK1/2的表达明显降低，p-p38、p-JNK的表达无明显变化，表明白芥子穴位贴敷能够抑制肝癌移植瘤中ERK1/2的激活，这可能是其抑制肝癌移植瘤生长的相关机制。

ERK1/2通路激活后，能够调控下游多种增殖、侵袭基因的表达。CyclinD1和c-myc是受到ERK1/2通路调控的增殖基因，两者均能加速细胞周期及细胞有丝分裂，对细胞增殖起促进作用[13，14]；波形蛋白和E-钙黏蛋白是受到ERK1/2通路调控的侵袭基因，在上皮间质转化过程中，前者起促进作用、有利于细胞侵袭，后者起抑制作用、阻碍细胞侵袭[15]。本实验观察到移植瘤中cyclinD1、c-myc、波形蛋白的表达降低，E-钙黏蛋白的表达增加，与ERK1/2激活受抑制的结果吻合，进一步验证了白芥子穴位贴敷具有抑制ERK1/2通路激活的作用。在此基础上，本实验还设计了过表达ERK1/2的腺病毒，注射腺病毒以增加ERK1/2的表达、对抗白芥子穴位贴敷抑制ERK1/2激活的作用，结果观察到ERK1/2腺病毒削弱了白芥子穴位贴敷抑制肝癌移植瘤生长、调节下游基因表达的作用，由此证实抑制ERK1/2激活是白芥子穴位贴敷抑制肝癌移植瘤生长的相关分子机制。