松郁安神方对失眠大鼠基底核多巴胺和腺苷含量的影响

王秀峰 张瑜 曾雪爱 张一帆 黄俊山

(福建省中医药科学院，福州，350003)

失眠是睡眠障碍最常见的一种疾病，以睡眠时间不足或睡眠质量下降为特征，以入睡困难、易醒或醒后难以入睡为常见表现，临床上失眠患者数量呈现逐年增长趋势，长期的失眠会严重影响工作和生活[1]。中医许多学者认为失眠的病机当以肝郁为首[2]，故治疗失眠应以着重调理肝的功能为基础，即遵照中医的治则应该予以疏肝解郁安神之法。松郁安神方(SYF)是黄俊山教授临床上使用疏肝安神法治疗失眠的经验方，疗效确切，不良反应小。但是，SYF治疗失眠的药理机制还不是很明确，本研究通过失眠大鼠模型，给予SYF和西药治疗，以大鼠基底核组织中多巴胺和腺苷含量变化为切入点，探讨松SYF防治失眠的作用机制，为丰富疏肝安神法治疗失眠提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 实验选用SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，体质量(220±10)g，由上海斯莱实验动物有限公司提供。实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005，质量合格证号：20170005004461，饲养于福建省中医药科学院动物实验室，恒温(22±1)℃和12 h:12 h固定照明节律(08:00开灯)的环境下，并可自由摄取食物和水。

1.2 实验药物 中药复方SYF由甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、酸枣仁15 g、夜交藤30 g、生龙骨30 g(先煎)、珍珠母30 g(先煎)、丹参15 g组成[3]。中药饮片购于鹭燕(福建)药业股份有限公司。以上药物一次性煎煮，分装后-20 ℃保存备用。大鼠用量为成人6倍(按体质量计算)剂量，按15 mL/kg灌胃给药，1次/d，给药时间1周[4]。阿普唑仑片(批号：20190417)，购于福建省第二人民医院。

1.3 主要试剂和仪器 Rat DA ELISA Kit(货号：ml003201)和Rat Adenosine ELISA Kit(货号：ml058881-C)购于mlbio公司。对氯苯丙氨酸(PCPA)(货号：C6506-25G)购于Sigma公司。酶标仪(美国BioTek，800TS)。

1.4 失眠大鼠模型的建立 PCPA按300 mg/kg溶于弱碱性生理盐水中，配制成混悬液，连续腹腔注射PCPA2d，建立大鼠失眠模型。实验大鼠出现昼夜节律消失，白天活动增多，睡眠减少直至消失，进食及饮水增多等整体观察与正常组有明显不同表明造模成功[5]。

1.5 实验大鼠的分组、给药及取材 造模成功后分成以下几组：对照组、模型组、SYF低剂量组、SYF高剂量组和西药阿普唑仑组，每组大鼠12只。SYF低剂量组按8.5 g/kg灌胃给药，1次/d，1周；SYF高剂量组按17 g/kg灌胃给药，1次/d，1周。阿普唑仑用蒸馏水配制成混悬液，用量为0.04 mg/kg，灌胃给药，1次/d，1周。对照组和模型组给予同等体积的生理盐水灌胃，1次/d，共7 d。以上各组，均按15 mL/kg体质量灌胃。

实验结束，将实验大鼠用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，腹主动脉取血5 mL装到抗凝管中，离心取上清，分装EP管中冻存备用。取血后，断头，剪开头皮，用血管钳揭去颅骨和硬脑膜，剪断双侧视神经后用眼科镊子迅速取出大鼠的整个脑组织。用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，置于液氮或-80 ℃保存备用。

1.6 神经递质的检测 神经递质的检测方法按照Rat DA ELISA Kit和Rat Adenosine ELISA Kit检测试剂盒说明书进行。取所需检测的大鼠血浆样本各50 μL，不同浓度标准品各50 μL分别加入96孔酶标板中。标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL，封板，37 ℃温育60 min。然后洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，450 nm测OD值，计算样本的浓度。

2 结果

2.1 用药前后实验大鼠的一般情况差异 实验期间对照组的大鼠，饮食没有明显的变化，体质量缓慢增加，睡眠活动正常，毛色有光泽，其他生理状况正常。在造模和用药期间，模型组大鼠的饮食增加，白天和夜间活动比对照组增加，睡眠减少，精神状态差，烦躁，皮毛颜色欠光泽，体质量增长与对照组和观察组差异有统计学意义。中药复方SYF在改善失眠引起的症状上优于西药阿普唑仑。

2.2 不同药物处理对大鼠基底核组织中DA含量的影响 为了检测不同药物对实验大鼠基底核组织中DA含量的影响，采用Rat DA ELISA Kit检测用药处理后各组大鼠基底核组织中DA含量。结果如图1所示，与对照组大鼠基底核组织中DA含量比较，模型组大鼠基底核组织中DA含量显著升高(P<0.01)，阿普唑仑组大鼠基底核组织中DA含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，阿普唑仑组、SYF高剂量组和SYF低剂量组大鼠基底核组织中DA含量均显著下降(P<0.01)。同阿普唑仑组比较，SYF高剂量组(P<0.05)和SYF低剂量组(P<0.01)比较差异均有统计学意义。SYF高剂量组和SYF低剂量组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组实验大鼠基底核组织中DA含量比较

2.3 不同药物处理对大鼠基底核组织中腺苷含量的影响 同样，我们采用了Rat Adenosine ELISA Kit检测了用药处理后各组大鼠基底核组织中腺苷含量。结果如图2所示，与对照组大鼠基底核组织中腺苷含量比较，模型组大鼠基底核组织中腺苷含量显著降低(P<0.01)，阿普唑仑组和SYF高剂量组大鼠基底核组织中腺苷含量显著升高(P<0.01)。与模型组比较，阿普唑仑组、SYF高剂量组和SYF低剂量组大鼠基底核组织中腺苷含量均显著上升(P<0.01)。同阿普唑仑组比较，SYF高剂量组和低剂量组基底核组织中腺苷含量比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。SYF高剂量组和SYF低剂量组之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组实验大鼠基底核中腺苷含量比较

3 讨论

目前，各种社会因素造成了失眠人群的不断增长，长期失眠则会严重影响生命质量。长期失眠患者病程较长，易反复发作，难以速愈。临床缺乏理想的治疗失眠的药物，中医药治疗失眠目前也取得了很大的进步，疗效好，不良反应小的优势得到了一定的认可[6]。本研究也发现了，中药复方SYF在改善由失眠引起的症状上比西药阿普唑仑效果好，这也就证实了中医药治疗失眠的优势。因此，研究中医药防治失眠，揭示其药理作用机制具有一定的科学意义。

近几年来，越来越多的实验证实基底核(Basal Ganglia，BG)在睡眠与觉醒的转换中起着重要的作用。基底核由纹状体、苍白球、丘脑底核和黑质4个主要的核团组成，它们在睡眠与觉醒的调节中又各自起着不同的作用。腺苷A1受体或A2A受体分别与多巴胺D1受体或D2受体在基底核中呈现高表达[7]。多巴胺是脑内含量最多的对维持觉醒起着重要调节作用的兴奋性神经递质[8]。DA能神经元与睡眠、觉醒脑区间存在广泛的纤维联系，提示DA系统可能参与了睡眠——觉醒的调控[9]。动物实验表明，破坏中脑黑质的DA系统后，动物在行为上不能表现为觉醒，但在脑电图上呈现出明显的觉醒状态的快波。精神运动兴奋药如哌醋甲酯，可引起觉醒延长并产生强烈的代偿性睡眠反弹[10]。腺苷是研究发现的最强的内源性促睡眠物质之一，腺苷及其受体作为镇静催眠的新靶点具有诱人的前景。腺苷水平变化与睡眠呈显著地正相关，与代谢产物稳态平衡调节睡眠的理论一致。在睡眠剥夺时脑内腺苷水平下降，睡眠恢复时腺苷水平增高[11]。

本研究发现，同对照组比较，失眠模型组大鼠基底核组织中的兴奋性神经递质DA含量显著的增加。给予模型大鼠中药复方SYF治疗能够显著性的抑制DA的释放作用，使DA恢复到正常水平。同对照组比较，失眠模型组大鼠基底核组织中的抑制性神经递质腺苷含量显著的降低，给予模型大鼠中药复方SYF治疗能够显著性的增加腺苷的释放作用，使腺苷恢复到正常水平。以上实验结果部分证实了，中药复方SYF在改善由失眠引起的症状方面效果是优于西药阿普唑仑的。睡眠剥夺可以造成的失眠模型大鼠基底核组织中神经递质DA和腺苷的调节失控。给予中药复方SYF治疗后，失眠大鼠基底核组织中神经递质DA和腺苷含量回归到正常水平，表明了疏肝安神法防治失眠的作用机制可能与调控基底核中DA和腺苷释放途径相关。

综上所述，疏肝安神的中药复方松郁安神方能够通过调节基底核中DA和腺苷释放，达到治疗失眠的目的。关于疏肝安神类中药如何调控基底核中DA和腺苷释放防治失眠的机制还需要更深入的研究去证实。