超声快速石蜡切片在脱落细胞学诊断中的应用

罗梓垠，吉洪亮，章诗伟

（湖北省中西医结合医院病理科，武汉 430015 ）

脱落细胞学是细胞病理学的一个重要分支，它主要是通过收集人体自然脱落的细胞进行制片来进行病理诊断，有别于传统的组织学病理诊断，脱落细胞学检查因可反复收集取材标本，对患者创伤小，操作简单，现已成为病理科的常规诊断途径之一[1]。新型环保超声处理试剂配合超声快速组织处理仪的使用，使得病理标本的制片时间大大缩短。以往研究[2,3]表明其非常适用于组织标本的处理，与传统组织处理方法相比较，HE染色、免疫组织化学染色等结果均一致。本文用新型环保超声处理试剂配合超声快速组织处理仪对脱落细胞进行处理，与传统常规制片方法进行比较，探讨其应用于脱落细胞学诊断的可行性。

材料与方法

1 标本

收集湖北省中西医结合医院病理科2020年3月到2021年3月之间临床送检的胸水、腹水脱落细胞学标本各30例。

2 主要仪器和试剂

HT‐3快速超声组织处理仪（山东骏腾医疗科技有限公司），全自动封闭式脱水机（Leica ASP200S），生物组织包埋机（Leica EG1150H），组织切片机（Leica RM2135），生物组织摊烤片机（Leica HI1210），HE自动染色机（达科为生物技术有限公司），电热恒温培养箱（上海福玛DPX‐9002B‐1/2），医用离心机（中佳SC‐2546）。

新型环保超声处理试剂（山东骏腾医疗科技有限公司），4%中性缓冲甲醛（上海初雷生物技术有限公司），不同梯度乙醇、正丁醇（国药集团化学试剂有限公司），鼠抗人TTF‐1、NapsinA、CK7、CK20、CEA、EMA、CK8/18、CK7、CDX2、CD10、vimentin单克隆抗体（即用型，福州迈新生物技术开发有限公司），兔抗人ER、PR单克隆抗体（即用型，福州迈新生物技术开发有限公司），过氧化物酶偶联的抗鼠/兔IgG聚合物（即用型，福州迈新生物技术开发有限公司），抗酸染色试剂（珠海贝索生物技术有限公司）。

3 组织处理

标本收集后，将标本进行离心沉淀。弃去上清液后，用95%的酒精使其表面短暂硬化。再离心弃去上清后，用镊子夹出离心沉淀物。将离心沉淀物分为二份，分别滴上苏木素后用擦镜纸包裹，置于相应的包埋框内。将其分为二组：快蜡组和常规组。快蜡组：总计20 min，采用新型环保超声处理试剂配合超声快速组织处理仪。常规组：总计12 h，采用传统常规组织处理程序，在自动脱水机里完成固定、脱水、透明等过程。

快蜡组处理：将放有细胞离心沉淀物的包埋盒整齐放入组织处理专用容器内。倒入新型环保超声处理试剂，保证试剂将标本浸没。盖上内盖，设置温度为46℃，处理时间为6 min。之后更换新的新型环保超声处理试剂，启动进行组织标本二次处理。温度为46℃，处理时间为6 min。二次处理结束后，拿出包埋盒，将细胞离心沉淀物取出，在纸巾上尽量蘸干试剂，再将细胞离心沉淀物重新放入包埋盒内。将其放入有蜡液的浸蜡专用容器内。设置温度为60℃，处理时间为8 min开始组织处理。结束后，将标本取出置于包埋机上包埋。

快蜡组和常规组在脱水完成后，同时进行切片，HE染色、免疫组织化学染色和抗酸染色。

4 免疫组织化学染色

快速石蜡切片和常规石蜡切片脱蜡至水后进行Envision法免疫组织化学染色：用PBS冲洗切片3次，每次3 min；柠檬酸高压修复2.5 min，冷却至室温后，用PBS冲洗切片3次，每次3 min；滴加内源性过氧化物酶阻断剂孵育10 min，用PBS冲洗切片3次，每次3 min；滴加一抗：胸水细胞蜡块切片滴加TTF‐1、NapsinA、CK7、CK20、CEA、EMA抗体，腹水细胞蜡块切片滴加CK8/18、CK7、EMA、CDX2、CD10、vimentin、ER、PR抗体，37℃孵育50min后再用PBS冲洗切片3次，每次3 min。滴加二抗，室温孵育30 min后再用PBS冲洗切片3次，每次3 min；DAB显色10 min后，苏木素复染、分化、脱水、透明、封片镜检。

5 抗酸染色

快速石蜡切片和常规石蜡切片脱蜡后不过酒精直接流水冲洗，滴加石碳酸复红室温染色15 min。流水冲洗后沥干，滴加酸性酒精脱色直至切片上红色消失。水洗，用亚甲基蓝溶液复染25 s。水洗，冷风吹干，封片。

结 果

1 快蜡组HE染色效果优于常规组

快蜡组切片完整，厚薄均匀。镜下见切片透明度好，细胞核与细胞质染色对比清晰，红蓝对比分明。相较于常规组HE染色切片，细胞固脱更好，细胞形态更加饱满，结构完好，无收缩（图1）。

图1 同一胸水细胞蜡块两组HE染色效果比较。A，快蜡组；B， 常规组。比例尺，100μmFig. 1 Comparison of HE staining effect between two groups with the same pleural effusion cell paraffn block. A, fast paraffn section group; B, con‐ventional group; scale bar, 100μm

2 快蜡组免疫组织化学染色效果与常规组相似

快蜡组镜下见细胞结构清晰完整，阳性结果定位准确，阳性强度好，无非特异性着色，背景干净。与常规组切片比较无明显差异（图2）。

图2 同一胸水细胞蜡块两组TTF‐1免疫组织化学染色效果比较。A，快蜡组; B， 常规组。比例尺，100μmFig.2 Comparison of TTF‐1 immunohistochemical staining effect between two groups with the same pleural effusion cell paraffn block. A, fast paraffn group; B, conventional group; scale bar, 100μm

3 快蜡组抗酸染色效果与常规组相似

快蜡组抗酸染色阳性组镜下见红色的簇状杆菌，常规组镜下亦见到阳性杆菌，两者比较无明显差异（图3）。

图3 同一胸水细胞蜡块两组抗酸染色效果比较。A，快蜡组; B，常规组。箭示阳性杆菌。比例尺，100μmFig.3 Comparison of acid fast staining effect between two groups with the same pleural effusion cell parafin block. A, fast paraffn section group; B,conventional group; arrows show positive bacilli; scale bar, 100μm

讨 论

脱落细胞包括浆膜腔积液脱落细胞、呼吸系统脱落细胞、子宫颈及阴道脱落细胞、脑脊液细胞及脱落细胞等[4]。常规的脱落细胞涂片易出现细胞厚涂造成细胞重叠、不能长期保存、观察细胞数量有限，不易进行HE染色、免疫组织化学染色及特殊染色，容易掉片，流程也相较于传统蜡块切片更加繁琐复杂等问题，细胞蜡块则可有效解决上述问题[5]。同时为了更好地服务于临床，让临床医生更早明确患者的病情，病理科就需要提高病理医生的诊断效率。因此，应用新的技术和试剂来提高出片速度，配合病理医生的诊断工作变得刻不容缓。

超声快速组织处理仪的工作原理是利用超声波结合水浴加热的方法，超声波产生的高频热能使液体中发生规律的分子运动，加快有机溶剂对组织中水的置换作用，增强溶剂的穿透性。而水浴加热，则增强有机溶剂与组织间液之间弥散、置换的频率，加快组织的处理过程[6]。HT‐3快速超声组织处理仪能够针对不同的组织进行不同的温度及时间的设定，使得处理过程更加具有针对性和有效性，确保对组织的处理更加柔和、均匀，这有助于后续的切片、染色及诊断[7]。新型环保超声处理试剂配合HT‐3快速超声组织处理仪处理组织集固定、脱水、透明3个功效为一体，不仅能显著缩短组织处理的时间，且新型环保超声处理试剂中不含正丁醇、二甲苯等有害物质，对工作环境污染小，不会对病理科技术员的身体健康造成伤害[7]。

本研究结果表明脱落细胞的快蜡HE染色切片无皱褶，裂隙和刀痕，透明度好，红蓝对比分明。相较于常规组HE染色切片，快蜡HE染色的细胞形态更加饱满，结构完好，完全符合优质HE染色切片的标准，这也更加有利于病理诊断医师的镜下判读。其原因可能是快速石蜡处理缩短了脱落细胞的固定、脱水和透明时间，使细胞形态结构保留的更加完整，更接近于细胞生活时的状态。免疫组织化学染色中，胸水脱落细胞检测了TTF‐1、NapsinA、CK7、CK20、CEA、EMA等肺部肿瘤相关指标，腹水脱落细胞检测了CK8/18、CK7、EMA、CDX2、CD10、Vimentin、ER、PR等泌尿生殖系统肿瘤相关指标。切片镜下观察发现细胞结构清晰完整，阳性结果强度好，定位准确。背景干净，无非特异性着色。其结果与常规组切片的免疫组织化学染色结果比较均无明显差异，表明对脱落细胞进行快速石蜡处理能较好的保留组织的抗原性，使抗原物质不发生弥散和抗原性丢失。

对于高度怀疑为结核患者的脱落细胞学标本，我们进行了抗酸染色。研究结果显示快蜡组抗酸染色阳性者切片镜下可见红色的簇状杆菌，相对应的常规组抗酸染色结果也为阳性。表明快蜡组结果与常规组切片抗酸染色结果比较无明显差异，提示快速石蜡处理不会使结核杆菌脱色，不会影响结果的判读。

以上结果均证实了快速石蜡切片完全可以满足日常脱落细胞学病理诊断的需要。且常规组的细胞蜡块处理程序一般需要12h，快蜡组则仅需要20min。因为常规脱水时间较长，所以病理科脱水机一般是晚上开始运行，上机的组织均需到第二天才能进行下一步的处理。而新型环保超声处理试剂配合超声快速组织处理仪的使用可以使得当天14点前收集的标本当天即可完成细胞蜡块的制作，HE染色，特殊染色及诊断。相比较常规出片的流程时间至少可以提前一天发出病理诊断报告，这大大缩短了制片时间，提高了工作效率及诊疗速度，更有助于提高医院平均住院率和周转率，节省患者的时间，方便临床科室治疗工作的开展。综上所述，对脱落细胞进行超声快速石蜡的处理，可以应用于脱落细胞学的病理诊断。