银杏叶提取物761对矽肺大鼠的防护作用

樊巍，熊震

（1陆军军医大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，重庆 400038；2重庆市红十字会医院（江北区人民医院）感染科，重庆 400020）

矽肺是由于长期大剂量暴露于二氧化硅（SiO2）粉尘而引起的一种以肺部炎症和纤维化为主要病理特点的职业病。矽肺预后较差，晚期以肺间质重度纤维化和呼吸衰竭为主要症状，极易导致死亡。由于工业化造成的矿场环境中大气污染和SiO2粉尘颗粒弥散等原因，近年来矽肺发病率呈逐年上升趋势[1]。目前矽肺属于进行性肺疾病，且其具体机制并不完全清楚，目前尚无特效药物[2]。SiO2粉尘可被肺中的巨噬细胞吞噬，形成矽结节并累及肺泡，释放促炎性介质、氧自由基及促纤维化因子等，诱导肺成纤维细胞增殖、分化并分泌胶原蛋白，最终导致纤维化形成[3,4]。这种病理改变还增加患者心衰的发病风险，严重影响着患者生活质量[2,5]。因此，探索新的药物来抑制矽肺进展尤为迫切。

银杏叶提取物761（Ginkgo biloba Extract 761，EGb761）是从银杏叶中提取的一种具有抗炎、抗氧化和抗动脉硬化的银杏内酯类黄酮化合物[6]，目前已经应用于心血管类疾病的治疗。另外，近年来通过动物模型发现，EGb761具有缓解肾纤维化、肝纤维化和肺纤维化的作用[7‐9]。EGb761对矽肺的作用的研究尚少，本研究利用SiO2气管灌注法构建矽肺大鼠模型，给予EGb761干预，通过观察肺部病理形态改变的状况，来评估其作为抗矽肺的潜力并分析其机制。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验动物

6~7周龄雄性SD大鼠购自第三军医大学第三附属医院野战外科研究所[许可证号：SCX‐K(渝)2017‐0005]，饲养于SPF动物房，并控制温度（23~25°C）、相对湿度（45%~65%）和光照（12 h光照循环）。所有大鼠可自由摄食饮水。饲养1周后进行实验。

1.2 主要实验试剂

SiO2颗粒（纯度＞99.9%；货号：85356）购自美国Sigma公司；EGb761购自广州和博生物科技有限公司；大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor‐α，TNF‐α）（货号：SEA133Ra）和白介素6（interleukin 6，IL‐6）（货号：SEA079Ra）ELISA试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司；大鼠IL‐1β ELISA试剂盒（货号：SBJ‐R0546）和Van Gieson（VG）染色试剂盒（货号：SBJ‐0297）购自南京森贝伽生物科技有限公司；HE染色试剂盒（货号：G1120）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：PC0020）、ECL Plus超敏发光液（货号：PE0010）、小鼠抗β‐actin单克隆抗体（货号：K200058M）和免疫组织化学染色试剂盒（货号：SP0041）购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）多克隆抗体（货号：ab125943）和小鼠抗α‐平滑肌肌动蛋白（α‐smooth muscle actin，α‐SMA）单克隆抗体（货号：ab7817）购自英国Abcam公司；兔抗I型胶原蛋白（type I collagen，COL I）多克隆抗体（货号：14695‐1‐AP）和兔抗纤维连接蛋白（fibronectin，FN）多克隆抗体（货号：15613‐1‐AP）购自美国Proteintech公司；过氧化物酶标记的抗小鼠和抗兔二抗购自上海碧云天生物科技有限公司。

2 方法

2.1 矽肺大鼠模型构建及分组

只大鼠分为空白对照组（Control）、EGb761高剂量对照组（Control+EGb761‐H）、矽肺模型组（SiO2）、低剂量EGb761处理组（SiO2+EGb761‐L），中剂量EGb761处理组（SiO2+EGb761‐M），高 剂量EGb761处理组（SiO2+EGb761‐H），每组5只。空白对照组大鼠不进行处理，直接饲养；EGb761对照组大鼠每日按照灌胃给药方式给予大鼠100 mg/kg EGb761，持续4周；按照参考文献[10]方法，矽肺模型组大鼠给予50 mg/mL SiO2悬液气管内灌注（SiO2颗粒气管灌注前先研磨0.5 h，加水制备成50 mg/mL悬液，然后用注射器气管灌注1 mL）后，继续饲养4周；低、中和高剂量EGb761处理组大鼠分别在给予SiO2气管灌注后1 d起，每天再分别灌胃给予20、50和100 mg/kg EGb761，持续4周。

2.2 肺组织病理形态学观察

麻醉处死各组大鼠，取肺组织用石蜡包埋。按照HE染色试剂盒说明书，取各组大鼠肺石蜡切片（6 μm厚），脱蜡至水化后，用苏木素溶液染色5 min，自来水冲洗2 min，盐酸乙醇分色约5 s，自来水冲洗10 min，伊红溶液染色3 min，依次常规脱水、透明和中性树胶封片后，用显微镜拍摄肺组织的HE染色图像。按照VG染色试剂盒说明书，取各组大鼠肺石蜡切片（6 μm厚），脱蜡至水化后，Weight铁苏木素溶液染色5 min，自来水冲洗1 min，盐酸乙醇分色约2 s，自来水冲洗10 min，VG溶液染色2 min，用滤纸吸除多余溶液，95%乙醇快速分化脱水，无水乙醇脱水，二甲苯透明和中性树胶封片后，用显微镜拍摄肺组织的VG染色图像。

2.3 ELISA检测

取各组大鼠的肺组织在冰上匀浆后，12000 r/min离心10 min收集上清液。上清液先用BCA法测蛋白浓度后，然后根据大鼠TNF‐α、IL‐6和IL‐1β ELISA试剂盒说明书，用ELISA法检测上清液中TNF‐α、IL‐6和IL‐1β含量，最后根据上清液中的蛋白浓度对上清液中TNF‐α、IL‐6和IL‐1β含量进行标准化处理。

2.4 免疫组织化学染色

取各组大鼠的肺石蜡切片（6 μm厚）在脱蜡至水化后，用3%H2O2浸泡切片10 min以除去内源性的过氧化氢酶，并用清水洗涤2次后，用煮沸柠檬酸缓冲液浸泡2 min以修复抗原。用PBS洗涤2次后，用10%BSA组织封闭液封闭30 min后，分别室温孵育一抗α‐SMA和CTGF（均1:300）、COL Ⅰ和FN（均1:200）2 h。用PBS洗涤3次后，室温孵育生物素标记的抗小鼠或抗兔抗体（二抗）（1:200）45 min；再次用PBS洗涤3次后，室温孵育过氧化物酶标记的链霉素（1:200）45 min。用PBS洗涤3次后，用DAB显色液显色后用苏木精复染，然后自来水冲洗后，一次经脱水、透明和封片后，用显微镜观察。

2.5 Western blot检测

取各组大鼠肺脏组织，采用RIPA裂解液萃取全蛋白。采用BCA法将各组蛋白样品定量至相同浓度后，取35 µg蛋白进行SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电泳。并将电泳后的蛋白质电转移至PVDF膜。之后，利用5%脱脂牛奶室温下封闭1 h并以1:2000的稀释比例孵育一抗体（α‐SMA、COLI和FN）， 4 °C过夜。次日，以TBST洗涤后以过氧化物酶标记的抗兔和抗小鼠二抗（1:2000）室温孵育1 h，以TBST洗涤后利用化学发光成像仪显影。

3 统计学方法

实验数据均采用均数±标准差表示，并利用Graphpad Prism软件进行统计学分析。多组数据均数的两两比较，采用单因素方差分析后LSD法。P＜0.05时的差异被认为具有统计学意义。

结 果

1 EGb761可缓解矽肺大鼠肺组织病理学变化

HE和VG染色结果（图1）显示，空白对照组和EGb761对照组的肺组织形态正常；矽肺模型组的肺组织呈现矽结节，且在矽结节周围伴有炎细胞浸润、肺泡损伤和大量的胶原沉积，出现较多不规则的肺泡间隔；高、中和低剂量EGb761处理组SiO2诱导的上述病理改变均明显减轻，且以高剂量组缓解程度最为明显。

图1 EGb761对矽肺大鼠肺组织病理学变化的影响。HE‐L，HE染色低倍图；HE‐H，HE染色高倍图（低倍图中方框区域放大）；SN，矽结节；箭头指示炎性细胞Fig. 1 Effect of EGb761 on pathological changes in the lung tissue of silicosis rats. HE‐L, low power image with HE staining; HE‐H, high power image with HE staining (enlargement of the box areas in low power images). SN, silicotic nodule; arrows indicate inflammatory cells

2 EGb761降低矽肺大鼠肺组织中促炎细胞因子水平

为了检测SiO2诱导肺纤维化过程中的炎症情况，本研究采用ELISA检测大鼠肺脏组织的促炎细胞因子IL‐6、IL‐1β和TNF‐α表达水平，结果显示，矽肺模型组肺组织中IL‐6、IL‐1β和TNF‐α的表达水平较空白对照组均增高，EGb761处理能降低SiO2诱导的肺组织中上述3种蛋白的表达，且以高剂量组效果最为明显（图2）。

图2 EGb761抑制矽肺大鼠肺组织中促炎细胞因子IL‐6、IL‐1β和TNF‐α的水平。与空白对照组比较：*P＜0.001；与模型组比较：#0.01＜P＜0.05，##0.001＜P＜0.01，###P＜0.001；n=5Fig. 2 The inhibitory effect of EGb761 on the level of pro‐inflammatory factors IL‐6, IL‐1β and TNF‐α in the lung tissues of silicosis rats. *P＜0.001,compared with normal control group; #0.01＜P＜0.05, ##0.001＜P＜0.01, ###P＜0.001, compared with model group; n=5

3.1 EGb761降低矽肺大鼠肺组织中α‐SMA水平

α‐SMA是肌成纤维细胞标记物，肺成纤维细胞集聚能异常过量合成和分泌胶原蛋白，导致肺纤维化[11]。免疫组织化学和Western blot检测（图3）显示，空白对照组和EGb761对照组的肺组织中α‐SMA水平无明显差异；相对于空白对照组，矽肺模型组的肺组织中α‐SMA水平明显增高，而EGb761处理可明显抑制矽肺大鼠肺组织中α‐SMA水平的增高，以高剂量组效果更为明显。

图3 EGb761对矽肺大鼠肺组织中α‐SMA水平的影响。A，α‐SMA水平的代表性免疫组织化学染色结果。B，α‐SMA水平的代表性Western blot检测与统计学分析；与空白对照组比较：*P＜0.001；与模型组比较：#0.01＜P＜0.05，##0.001＜P＜0.01，###P＜0.001；n=5Fig.3 Effect of EGb761 on the level of α‐SMA in the lung tissues of silicosis rats. A, rep‐resentative immuno‐histochemical staining results of α‐SMA; B,representative West‐ern blotting results and statistical anal‐ysis of α‐SMA level;*P＜0.001, compared with normal control group; # 0.01＜P＜0.05,## 0.001＜P＜0.01, ###P＜0.001, compared with model group; n=5

3 EGb761降低矽肺大鼠肺组织中纤维化相关蛋白水平

COLI、FN和CTGF在肺纤维化发展过程中发挥重要作用[12]，免疫组织化学染色和Western blot分析（图4）显示，矽肺模型组肺组织中COLI、FN和CTGF水平较空白对照组均增高，EGb761处理能降低SiO2诱导的肺组织中这3种蛋白的增高，且以高剂量组效果更为明显。

图4 EGb761对矽肺大鼠肺组织中COLI、FN和CTGF水平的影响。A，COLI、FN和CTGF水平的代表性免疫组织化学检测结果。B，COLI、FN和CTGF水平的代表性Western blot检测结果；C、D和E，COLI（C）、FN（D）和CTGF（E）水平的统计学分析；与空白对照组比较：*P＜0.001；与模型组比较：#0.01＜P＜0.05，##0.001＜P＜0.01，###P＜0.001；n=5Fig. 3 Effect of EGb761 on the level of COLI, FN and CTGF in the lung tissues of silicosis rats. A, representative immunohistochemical staining results of COLI, FN and CTGF; B, representative Western blotting results of COLI, FN and CTGF level; C, D and E, statistical analysis of the level of COLI(C), FN (D) and CTGF (E); *P＜0.001, compared with normal control group; #0.01＜P＜0.05, ##0.001＜P＜0.01, ###P＜0.001, compared with model group;n=5

讨 论

矽肺是世界尤其是发展中国家重要的健康问题，其形成的主要原因是由于长期暴露于SiO2粉尘的职业环境中，导致的肺部炎细胞活化及浸润、硅肺结节逐渐形成，进而引起肺功能受损和进行性纤维化[1]。目前尚无有效治疗措施[2]。EGb761已被证实其在动物模型的肾、肝和肺中具有抗炎及抗纤维化作用[7‐9]，而其在矽肺中的作用尚不完全清楚。本实验利用气管内灌注SiO2粉末来建立大鼠矽肺模型，并利用EGb761干预，发现EGb761能有效的缓解SiO2导致的大鼠肺部炎症及纤维化，提示EGb761可能是潜在的矽肺防护剂。

有研究[11]证实，异常活化增多的肺肌成纤维细胞过量合成和分泌的胶原蛋白会导致肺纤维化的形成。因此，本研究首先检测了肺肌成纤维细胞标记物α‐SMA和与肺纤维化相关的COLI和FN，发现EGb761能抑制SiO2诱发的肺肌成纤维细胞的集聚与COLI的沉积并降低FN的表达水平。CTGF是一种富含半胱氨酸的细胞外基质相关分泌蛋白，在正常组织中表达量较低，但在纤维化的组织中显著上调[12,13]；因此，CTGF也被认为是胶原沉积和肺纤维化的病理标志物。有研究[14]表明，CTGF是TGF‐β下游因子，激活后可刺激成纤维细胞的增殖和促进其分泌和合成胶原蛋白。许多证据均表明CTGF、TGF‐β及FN在肺纤维化形成与进展中呈协同作用[12,14,15]。本研究同样显示，EGb761能抑制SiO2诱发的CTGF过度表达。炎性反应在肺纤维化形成和进展过程中也起着重要的促进作用。有研究[15]表明，TGF‐α可促进成肺纤维细胞分化，且可促进其分泌COLI和FN。IL‐6和IL‐1β也被发现是炎症和纤维化的前驱因子[16,17]。另外，TGF‐α可促进肺成纤维细胞中IL‐6和IL‐1β表达，且IL‐6和IL‐1β在动物模型和人的肺纤维化的组织中均被发现其显著升高[18]。本研究表明，EGb761可缓解由SiO2导致的肺的促炎因子TGF‐α、IL‐6和IL‐1β水平的升高。以上结果进一步证实了EGb761具有缓解SiO2诱发矽肺中的炎性反应和纤维化的作用。

综上，本研究证实了EGb761对SiO2诱导的矽肺具有缓解作用，其机制可能包括其具有缓解SiO2诱导的肺部的炎性反应以及肺成纤维细胞集聚和下调纤维化前驱蛋白的合成与分泌的作用。因此，EGb761具有临床上治疗矽肺的潜力。