副猪嗜血杆菌病灭活疫苗与猪瘟活疫苗混合免疫时的免疫效力评价

翟路峰 ， 高 曼 ， 张国良 ， 朱巧艳 ， 金云云 ， 廖永洪 ， 田克恭

(1. 国家兽用药品工程技术研究中心 ， 河南 洛阳 471003 ； 2. 普莱柯生物工程股份有限公司 ， 河南 洛阳 471000)

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种以高热和内脏器官严重出血为特征的猪的高度接触性传染病[1]。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎的接触性细菌传染病[1]。这2种疫病在我国临床猪场均呈现出高发病率、高死亡率的特点，是当前严重危害我国养猪业发展的重要传染病，疫苗免疫是预防和控制这2种疫病最为有效的途径[2-3]。我国临床猪场疫病繁杂，受到多种传染病的威胁，为使猪群免受疫病感染，多种疫苗需要在猪场中使用，而多次免疫接种容易引起猪只应激反应，且加重养殖人员的劳动负担。因此，在临床免疫过程中，如何在保证疫苗免疫效果的同时减少免疫次数成为当务之急。

通过2种或2种以上的疫苗混合免疫，达到一针两防或者一针多防的效果，是近年来养殖场疫苗免疫过程中一种新的尝试[4-7]。但并非所有疫苗都可以混合使用，已有研究表明，有些疫苗同时注射会对疫苗效力产生协同作用，有的会产生拮抗作用[8-11]。本试验通过副猪免疫攻毒试验和监测免疫后猪瘟抗体水平对国内首个水性佐剂副猪嗜血杆菌病灭活疫苗与猪瘟活疫苗混合免疫的效果进行评价，为这2种疫苗在临床中的联合使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 疫苗与细胞 猪瘟活疫苗(传代细胞源)，水性佐剂副猪嗜血杆菌病二价灭活疫苗(4型JS株+5型ZJ株)，均由普莱柯生物工程股份有限公司生产；ST细胞由国家兽用药品工程技术研究中心保存。

1.2 菌毒种 副猪嗜血杆菌4型JS株、副猪嗜血杆菌5型ZJ株和猪瘟病毒Thiverval株由国家兽用药品工程技术研究中心保存。

1.3 主要试剂 α-MEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液，均购自HyClone公司；猪瘟病毒抗体检测试剂盒，购自IDEXX公司；胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，均购自BD公司；新生牛血清，购自浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.4 试验动物 21～28日龄健康仔猪，共40头，CSFV抗体、HPS抗体均为阴性，购自洛阳周边农户家。

1.5 试验方法

1.5.1 HPS灭活疫苗稀释CSF活疫苗后CSFV含量测定 分别用HPS灭活疫苗和活疫苗专用稀释液将CSF活疫苗稀释成2 mL/头份，将稀释后的HPS、CSF混合疫苗和CSF活疫苗在25 ℃条件下放置2 h，每隔1 h取样，用含3%胎牛血清的α-MEM培养基将样品做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5三个稀释度，与分散好的ST克隆细胞同步接种于96孔细胞培养板，分别测定HPS、CSF混合疫苗和CSF活疫苗中的CSFV含量。

1.5.2 HPS灭活疫苗与CSF活疫苗混合免疫效果评价

1.5.2.1 动物分组与免疫 将上述40头健康仔猪随机分为8个组，5头/组。第1、2、3组试验猪于21～28日龄免疫HPS、CSF混合疫苗，2 mL/头(含CSF活疫苗1头份)，间隔3周，加强免疫HPS灭活疫苗，2 mL/头；第4、5组试验猪于21～28日龄免疫HPS灭活疫苗，2 mL/头，间隔3周，加强免疫HPS灭活疫苗，2 mL/头；第6组试验猪于21～28日龄免疫CSF活疫苗，1头份/头；第7、8组试验猪不免苗作为对照。

1.5.2.2 HPS部分效力评价 第1、4、7组试验猪于二免后2周，腹腔注射1个最小发病剂量HPS 4型JS株菌液，第2、5、8组试验猪于二免后2周，腹腔注射1个最小发病剂量HPS 5型ZJ株菌液，攻毒后连续观察14 d，观察并记录攻毒猪死亡和发病情况，攻毒后第14天对存活猪只进行安乐死后剖检，观察并记录各脏器病理变化，对各组试验猪发病情况进行分析。

1.5.2.3 CSF部分效力评价 对第3组和第6组试验猪在免疫前、免疫后2、4、6、8周采血、分离血清。用IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测各时间点血清中CSFV抗体，按试剂盒说明书进行检测和结果判定。用细胞中和试验法检测各时间点血清CSFV中和抗体：以CSFV Thiverval株和ST细胞作为试验用病毒和细胞，将病毒液稀释至200TCID50/100 μL，与等量2倍系列稀释的被检血清混合，37 ℃作用60 min，接种ST细胞，37 ℃、5%CO2条件下培养96 h，采用间接免疫荧光方法进行染色和结果判定。

1.6 统计分析 采用SPSS 23.0软件对CSFV抗体检测结果进行t检验分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 HPS、CSF混合疫苗中CSFV含量测定 将稀释后的HPS、CSF混合疫苗和CSF活疫苗在25 ℃条件下放置2 h，每隔1 h取样，分别测定HPS、CSF混合疫苗和CSF活疫苗中的CSFV含量，2 h内均未见明显下降。见表1。

表1 疫苗中CSFV含量测定结果Table 1 Determination results of CSFV content in vaccines

2.2 HPS灭活疫苗与CSF活疫苗混合免疫效果评价

2.2.1 HPS部分效力评价 二免后2周，分别对HPS、CSF混合疫苗免疫猪和HPS灭活疫苗免疫猪进行HPS 4型和HPS 5型强毒株攻毒，结果混合疫苗免疫猪HPS 4型强毒株和HPS 5型强毒株攻毒均能达到5/5保护，与HPS灭活疫苗免疫组效力相当。见表2。

表2 2种疫苗免疫仔猪后HPS攻毒保护结果Table 2 HPS challenge protection results of piglets immunized with two vaccines

2.2.2 CSFV部分效力评价 用猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测混合疫苗免疫组和CSF活疫苗免疫组(第3组和第6组)试验猪免疫前、免疫后2、4、6、8周血清中的CSFV抗体，结果如图1所示，混合疫苗免疫组免疫后2～8周CSFV抗体水平略高于CSF活疫苗免疫组，2个疫苗免疫组免疫后4、6、8周CSFV抗体水平存在显著差异(P<0.05)。用细胞中和试验法检测血清中CSFV中和抗体，结果2个组疫苗免后2、4、6、8周血清中CSFV中和抗体效价均差异不显著(P<0.05)，见表3。

表3 2种疫苗免疫仔猪后不同时间CSFV中和抗体检测结果Table 3 Detection of CSFV neutralizing antibody in piglets immunized with two vaccines at different time points

图1 2种疫苗免疫仔猪后不同时间CSFV ELISA抗体检测结果Fig.1 Detection of CSFV ELISA antibody in piglets immunized with two vaccines at different time points*：P<0.05

3 讨论

随着养猪业规模化、产业化程度的发展，我国的生猪养殖企业不论在饲养管理还是疫病防控方面都取得了长足进步，但与此同时还存在一个棘手的问题——我国猪群疫病繁杂，免疫疫苗种类多，这不仅加重了养殖场的劳动负担，多次免疫刺激还增加了猪群应激反应的概率。因此，如何在原有免疫程序基础上减少免疫次数且不影响疫苗免疫效果成为当务之急。为此，已有部分养殖场进行了不同疫苗混合免疫的尝试。

不同疫苗进行混合免疫不仅要求免疫途径一致、免疫时间相近，还需要考虑疫苗佐剂、灭活剂等诸多因素。不同佐剂系统的灭活疫苗相混可能会出现分层、破乳等情况，必然会对疫苗的免疫效果造成影响。灭活疫苗与活疫苗混合使用时要求灭活疫苗不能为以油为连续相的佐剂系统，且灭活疫苗的pH适宜活疫苗抗原的存活，灭活剂残留足够低，对活疫苗抗原无杀灭作用。考虑到以上各种因素之后，不同疫苗混合免疫后是否会相互干扰还需在靶动物上进行效力评价。

猪瘟和副猪嗜血杆菌病是临床猪场2种常见传染病，临床上这2种疫苗免疫时间接近，首免均在21～28日龄左右。本试验用商品化水性佐剂副猪灭活疫苗作为稀释液稀释猪瘟活疫苗制成混合疫苗，室温条件下放置2 h，猪瘟病毒含量未见下降，说明副猪灭活疫苗对猪瘟病毒无杀灭作用。用HPS、CSF混合疫苗免疫仔猪，并进行HPS 4型、HPS 5型强毒株攻毒，保护效果与单纯免疫副猪灭活疫苗无明显差异。监测混合疫苗免疫后试验猪血清中CSFV ELISA抗体和中和抗体，结果显示，2个疫苗免疫组免后2～8周CSFV中和抗体滴度差异不显著，而混合疫苗免疫组CSFV ELISA抗体还略高于单纯猪瘟活疫苗免疫组，这可能与副猪灭活疫苗中佐剂成分对猪瘟活疫苗的免疫效果起到了促进作用有关。综上所述，本试验中所用副猪嗜血杆菌灭活疫苗和猪瘟活疫苗可以混合后进行一次性注射，达到“一针两防”的效果，为临床中简化这2种疫苗的免疫程序提供理论参考。