2017—2019年我国部分规模场副鸡禽杆菌的感染状况分析

马国明 ， 尤永君 ， 牛 山 ， 冯敬敬 ， 范莉莉 ， 李春鹏 ， 张国中

(1．中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2．北农大科技股份有限公司 ， 北京 海淀 100083 ；3．天津瑞普生物技术股份有限公司 ， 天津 空港 300308)

鸡传染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)感染引起鸡的一种急性或亚急性上呼吸道传染病[1]。Apg感染后病鸡主要以鼻、窦黏膜及眼结膜发炎，面部肿胀，喷嚏，流涕、流泪、眶下窦肿等为特征[2]。发病鸡群表现采食量下降10%～50%，病死率可达5%～20%，能造成育成鸡生产不良和淘汰率增加，产蛋鸡产蛋率下降10%～40%[1]，给养殖业造成严重经济损失。该病由Beach于1920年首次报道[3]；De Blieck在1932年首次分离到病原体[4]。1962年，我国报道存在该病的疑似病例，1980年后，陆续有多个关于该病疑似病例的报道，冯文达最先于1987年分离到该病病原菌株[5]。1955年将该菌划归为禽巴氏杆菌[6]。Page采用传统血凝抑制(HI)试验将Apg分为 A、B、C三个血清型[7]。Kume等通过硫氰酸钾处理菌体细胞，再用超声裂解菌体细胞进行HI试验，提出一种血清学分类方法分别为A-1、A-2、A-3、A-4、B-1、C-1、C-2、C-3、C-4[8]。该病传染性较强且呈世界性分布，发展中国家鸡群发生该病时损失高于发达国家。在我国已有多个省市报道过传染性鼻炎的发生，发病率可达20%～50%，鸡群死亡率可达5%～20%[9]。近几年，蛋鸡、种鸡传染性鼻炎发生率明显增多，未免疫鸡群和免疫鸡群均有发生，主要与现阶段疫苗的血清亚型不对应有关。本试验通过对国内现阶段鸡传染性鼻炎的流行现状调查，了解国内流行的主要血清型和致病特点，为筛选出适合国内疫苗候选菌株提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料 2017年1月—2019年12月，采自全国各地240个规模化养殖场疑似IC发病鸡的1 403份病鸡头样品，样品低温运送至实验室后立即进行Apg分离培养。

1.2 主要试剂TaqDNA Polymerase、T4连接酶等试剂，均购自Fermentas公司；IPTG、X-gal、Ampicillin，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰酪蛋白胨大豆琼脂液体培养基(TSB)，均购自青岛海博生物技术有限公司。PCR引物由华大基因合成。

1.3 细菌分离培养和菌落形态观察 将病鸡鸡头置于生物安全柜内，用烧红的手术刀片烧烙眶下窦外表面2次，做到表面无菌，用无菌手术刀切开眶下窦，用高压过的棉拭子蘸取眶下窦黏液或浆液，无菌接种于TSA(含8%鸡血清和1%NAD)培养基上，将平皿倒置放在5%CO2、37 ℃培养箱中培养18～24 h，长出菌苔后，经多次单菌落划线纯培养后，观察细菌在TSA培养基上菌落形态。

1.4 革兰染色观察 挑取纯培养后的单菌落进行革兰染色鉴定，镜检观察细菌形态。

1.5 卫星现象观察 选取TSA平板的单个菌落在鲜血琼脂平板培养基上横向划5～7条横线，然后用接种环取表皮葡萄球菌从横线中间划一纵线，将划好的平皿倒置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24～40 h，观察分离菌是否在葡萄球菌周围出现卫星现象[1]。

1.6 过氧化氢酶试验 挑取典型菌落进行过氧化氢酶试验：取5 mL的3%的过氧化氢于安瓿瓶中，然后用接种环由固体培养基取菌苔2环，加到安瓿瓶中与过氧化氢混合，有大量气泡者即为阳性反应，澄清透明者即为阴性。

1.7 PCR检测 挑取疑似单菌落接种到TSB(加入8%鸡血清和1%NAD)液体培养基中，37 ℃ 160 r/min摇床培养12 h，将培养菌液当作模板，参考中华人民共和国农业行业标准《NY/T538—2015》的PCR方法扩增保守性片段16S rRNA基因进行特异性扩增。

1.8HMTp210基因扩增和测序分型 参照Sakamoto等[10]的方法，对PCR检测阳性的分离菌株进行HMTp210基因扩增，PCR产物经回收、质粒连接、细胞转化和阳性克隆鉴定后送华大基因进行测序，测序结果利用DNASTAR 5.0软件进行分析(Madison,WI53715,USA)，通过与GenBank中参考菌株的序列比对，初步了解Apg分离株的血清型。

1.9 代表菌株的血清型鉴定 根据临床发病情况选取正常免疫后发病，且发病率较高，发病的蛋鸡鸡群产蛋率影响严重的副鸡禽杆菌30株，包括HMTp210基因测序分型的A、B型和C型菌株各10株，利用经典血凝(HA)和HI 试验进行血清型鉴定和验证。

2 结果

2.1 细菌分离情况 2017—2019年共采集240个规模化养殖场1 403份疑似样品，共检出有细菌感染养殖场228个，场阳性率为95.0%，其中Apg阳性场119个，场阳性率为49.6%；共检出细菌1 250份，样品中细菌阳性率为89.1%，Apg共检出547份阳性，样品Apg阳性率为39.0%，见表1。

表1 2017—2019年副鸡禽杆菌PCR检测结果Table 1 PCR detection of Avibacterium paragallinarum from 2017 to 2019

2.2 分离菌培养、染色和培养特性 从疑似样品中分离到细菌后在TSA琼脂(加入8%鸡血清和1% NAD)平板上培养，呈现灰白色、半透明露珠样、圆形、光滑、边缘整齐、针尖样大小凸起的菌落。分离株纯化培养后，挑取单个菌落进行革兰染色，100倍镜检观察可见革兰阴性菌，短杆或球杆状，两级略有浓染。多单个存在，也有短链排列，呈现长短不一的形态。在血琼脂平皿上，分离株在金黄色葡萄球菌菌苔周围均能形成明显的“卫星现象”。分离株纯化培养后，挑取单个菌落进行过氧化氢酶试验，结果显示分离株的过氧化氢酶试验结果均为阴性。

2.3 PCR检测 来自不同地区的1 403份病料中，有1 250份样品能分离出细菌，经PCR鉴定有547份在约500 bp处出现了与预期大小一致的条带)，确定有547份副鸡禽杆菌阳性，部分样品的 PCR结果见图1。

图1 部分副鸡禽杆菌分离菌株的PCR检测结果Fig.1 PCR detection of Avibacterium paragallinarum in selected samplesM：DNA marker； 1:阴性对照； 2～24：临床分离菌株； 25：阳性对照M:DNA marker; 1:Negative control； 2-24:Clinical isolates; 25:Positive control

2.4 不同类别鸡群Apg检出率 对547份阳性样品进行品种分析，其中来自蛋鸡的样品911份，检出Apg阳性样本424份，占比46.5%；肉鸡样品共计492份，检测Apg阳性123份，占比25.08%。统计结果显示，不同品种、类型的鸡均有一定比例的副鸡禽杆菌阳性检出率。

2.5 不同区域鸡群Apg检出率 根据样品统计结果，2017—2019年在全国17个省市地区的547份Apg阳性样品分布不同，各省份Apg检出率差别较大，Apg检出率排名前5位的省份分别是河北、江苏、山东、河南和辽宁，检出率分别为56.1%、53.7%、52.4%、44.0%和38.1%，如表2所示。

表2 2017—2019年全国17个省市Apg检测结果Table 2 PCR detection of Avibacterium paragallinarum in 17 provinces of China from 2017 to 2019

2.6 不同日龄鸡群Apg检出率 通过对不同日龄(按照50日龄为标准划分)鸡群的Apg阳性样品的进行分析，显示鸡群在各个日龄均有一定比例的阳性检出率，其中301～350日龄时鸡传染性鼻炎检出阳性率最高，阳性率为81.5%。为进一步了解Apg每年的发病日龄趋势，对不同日龄的检测情况按照年份进行了统计分析，结果显示，2017—2019年不同日龄Apg检测阳性率每年间变化不大，鸡传染性鼻炎集中发病时间在100～350日龄；2017—2019年1～50日龄送检疑似Apg样品数分别为52份、63份和95份，1～50日龄检测阳性数占比分别为5.77%、9.52%和36.84%，送检总数量和阳性率逐年提高。

2.7 不同月份鸡群Apg检出率 将2017—2019年间传染性鼻炎检出数量绘制成散点图，由图2可知，每年8月份鸡传染鼻炎发生率开始增加，从当年的10月份到次年的5月份是传染性鼻炎检出较高的时段，从5月份开始，IC的阳性样品检出数量逐渐减少，8月份最低。结果表明鸡传染性鼻炎在气温波动较大的季节发生概率较大。

图2 2017—2019年间各月份Apg检测结果Fig.2 PCR detection of Avibacterium paragallinarum in different months from 2017 to 2019

2.8 Apg菌株PCR测序分型 选取119株分离株(如果同一养殖场分离到多个菌株，则选取1株纯化菌株)进行HMTp210基因的扩增，均能扩增出与预期大小一致的目的条带，部分样品扩增结果见图3。对获得的基因序列在NCBI上进行对比分析，检测到A型菌株56株、B型菌株14株、C型菌株49株。

图3 副鸡禽杆菌的HMTp210基因的PCR检测结果Fig.3 PCR detection of HMTp210 gene from Avibacterium paragallinarumM：DNA marker； 1～4和5～6：临床分离菌株；-：阴性对照； +：阳性对照M:DNA marker; 1-4 and 5-6:Clinical isolates;-:Negative control; +:Positive control

2.9 Apg菌株HI试验分型 通过经典的HA和HI试验对基因测序分型的30株副鸡禽杆菌进行血清型鉴定，结果显示30株副鸡禽杆菌中，血清型鉴定为A型的为10株，鉴定为B型的为10株，鉴定为C型的为10株。对比结果显示，血清学方法分型结果与PCR测序分型结果一致。

3 讨论

我国养鸡业发展迅速，集约化养殖量快速攀升，多数地区养鸡场较为集中，鸡场饲养密度大，面临严重的细菌性疾病的感染压力。特别是近些年，随着减抗政策的推行、食品药残监管和处罚力度增大，导致副鸡禽杆菌的发病率升高，给规模化养鸡场带来很大经济损失。鸡传染性鼻炎的发病表现也呈现多样化，其中地区、季节、品种和日龄均能影响IC的临床表现、发病率和死亡率，同时养殖场抗生素的不合理使用，既干扰了病原的分离，也给血清学方法进行诊断带来难度。因此，调查我国不同地区、季节、品种和日龄鸡群的传染性鼻炎的流行现状，对制定鸡传染性鼻炎的防控策略有重要意义。

在2017—2019年间，本实验室共收集来自全国17个省市地区240个规模养殖场的1 403份临床疑似副鸡禽杆菌发病鸡群的病料，经细菌分离、染色镜检及PCR扩增，共检测到547份阳性样品，119个养殖场Apg阳性，样品总检出率39.0%，场阳性率49.6%。结果显示，3年间样品阳性率分别为38.1%、45.7%和36.4%，场阳性率分别为45.9%、41.7%和56.1%。119株分离菌株的HMTp210基因测序分析得到A型菌株56株，B型菌株14株，C型菌株49株，表明A、B、C 三种血清型Apg菌株同时存在，Apg检测阳性的养殖场数量连续3年均超过40.0%，不同品种和日龄的鸡群均有不同程度感染Apg，近几年，副鸡禽杆菌的感染日龄提前的趋势明显；每年的10月份到次年的5月份Apg的检出率较高；按照各省份地区检测统计结果来看，Apg阳性检测率排名前5位的省份分别为河北、江苏、山东、河南和辽宁，均是国内养殖量多、养殖密度大的区域，从检出率数据分析，国内各养殖场对Apg的防控效果不佳，这说明鸡传染性鼻炎已经成为困扰养鸡场发展的重要疫病问题。

通过对分离菌株的HMTp210基因进行测序分析，与GenBank中序列对比进行Apg分型，结果表明我国国内现阶段存在A、B、C三种血清型的副鸡禽杆菌菌株，其中以血清A型最多，C型次之，再次是B型。结果表明我国鸡传染性鼻炎感染情况复杂，推测可能与现用疫苗血清型以及当前流行菌株的血清型不匹配，也和养殖场免疫程序不当有关。本试验通过比较30株Apg菌株的血凝抑制试验分型鉴定与PCR测序分型结果初步发现，利用HMTp210基因的扩增、测序以及序列比对进行分型，与经典血清学分型方法有100%的相关性。为临床疑似鼻炎样品提供了一种快速诊断和分型的方法，为科学有效防控鼻炎提供数据支持。由于本次试验的菌株数量有限，测序分型方法还需要大量的试验数据支持。

我国鸡传染性鼻炎的发病率和Apg的分离率越来越高，防控趋势愈之复杂，这种现状与多种因素都有关系，包括与我国目前临床应用鼻炎疫苗中的Apg菌株和大多数流行株血清型不匹配、畜牧养殖行业的减抗和限抗政策的实施、从业人员的管理和技术水平参差不齐等。因此，在疫苗防控上，研究针对国内流行株的疫苗显得尤为重要，尽量选择与地区流行菌株血清型一致的疫苗，加强免疫质量监管和效果评价。从生产管理角度，生产管理者要加强育雏育成期和产蛋高峰期的鸡群管理，务必做好饲养管理，加强养鸡场硬件的改造，以有利于改善季节交换时节的鸡舍温湿度和通风管理控制，从而保证鸡舍小气候稳定，防止鸡群受到冷刺激，为鸡群提供良好的环境。鸡群饲养周期必须要建立生物安全体系，要有严格的疾病防控措施，否则损失会越来越大。