奶牛安氏隐孢子虫巢氏PCR检测方法的建立及应用

张园园 ， 张百慧 ， 李 简 , 刘书婷 ， 韩 莹 ， 王燕春 ， 蔡亚南

(吉林农业大学动物医学院 ， 吉林 长春 130118)

隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由隐孢子虫感染引起的一类人兽共患的寄生虫病[1-2]。隐孢子虫病最常见的症状是腹泻，猪、羊、牛为该病病原体的主要宿主，动物感染后会表现出食欲减退、发热、腹泻腹痛、厌食消瘦、呕吐以及生长停滞等症状，最终导致生产性能下降甚至丧失，给畜牧业造成巨大经济损失[3-4]。

安氏隐孢子虫是引起奶牛胃肠道疾病的主要病原之一，患病奶牛常出现水样腹泻、脱水进而食欲减退、生产性能降低、产奶量下降，严重影响奶牛场的经济效益。目前，奶牛安氏隐孢子虫病尚无有效的疫苗和治疗药物。因此，建立快速、特异、敏感的奶牛安氏隐孢子虫的检测方法，明确奶牛场安氏隐孢子的流行特征尤为重要，可为安氏隐孢子虫病的防控提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂ExTaq酶为TaKaRa公司产品；粪便基因组DNA提取试剂盒为康为试剂生物科技有限公司产品。

1.2 样本 2018—2019年在河南、湖北和湖南的奶牛场共采集563份奶牛粪便，每份100 g，将其编号记录放入保鲜盒中带回实验室，4 ℃冰箱内保存。

1.3 卵囊的检测与收集 粪便先蒸馏水沉淀，后采用饱和蔗糖溶液漂浮法[5]，蘸取表面液膜，改良抗酸染色法染色镜检[6]。收集卵囊置于2.5%重铬酸钾溶液里保存，置于4 ℃冰箱备用。

1.4 DNA提取 按照试剂盒说明书提取卵囊的DNA，保存在-20 ℃冰箱备用。

1.5 引物设计与合成 在NCBI上的GenBank中下载安氏隐孢子虫18S rRNA和囊壁蛋白(COWP)基因序列，通过DNAMAN进行比较获得保守区，通过Prime 5.0在保守区设计巢氏PCR引物，见表1。

表1 安氏隐孢子虫巢氏PCR引物序列Table 1 Cryptosporidium andersoni nested PCR primer sequences

1.6 巢式PCR方法的建立 通过控制单一要素的改变，分别对样品和引物(0.5～2.0 μL)，退火温度(50～70 ℃)等条件进行优化，以获得最合适条件。1%琼脂糖凝胶电泳检测巢氏PCR产物。

1.7 特异性、敏感性和重复性试验

1.7.1 特异性试验 分别以大肠埃希菌、牛艾美尔球虫、弓形虫、微小隐孢子虫的基因组cDNA为模板，将安氏隐孢子虫基因作为阳性模板进行PCR扩增。

1.7.2 敏感性试验 把测定完成的标准安氏隐孢子虫DNA浓度10倍倍比稀释，以各浓度DNA作为模板，并参考Zhang等[7]的巢氏PCR方法，分3个组进行巢氏PCR扩增。

1.7.3 重复性试验 随机抽取获得的3个阳性样品用2种基因建立的2种PCR方法分别完成3次重复扩增，校验重复性。

1.8 巢式PCR检测 用建立的COWP基因巢氏PCR方法对18S rRNA基因巢氏PCR检测出的阳性样本进行检测。

2 结果

2.1 巢式PCR反应的优化与建立 巢式PCR反应体系总体积为25 μL，2种基因的两轮反应体系一致。反应体系：ddH2O 17.3 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物1 μL，Taq酶0.2 μL，样品1 μL。18S rRNA基因第1轮反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。第2轮反应退火温度为62 ℃。COWP基因的两轮反应条件与18S rRNA基因一致，退火温度为53 ℃。琼脂糖凝胶电泳结果显示，18S rRNA巢氏PCR和COWP巢氏PCR分别扩增出片段大小约为407 bp和430 bp的条带，与目的条带大小一致，如图1所示。

图1 巢式PCR扩增结果Fig.1 Nested PCR amplification resultsA:18S rRNA基因； B:COWP基因; M:DNA标准DL2 000； 1～4：样品编号； 5：阴性对照A:18S rRNA gene； B:COWP gene; M：DNA Marker DL2 000； 1-4：Sample number； 5：Negative control

2.2 巢式PCR检测

2.2.1 特异性试验 凝胶电泳结果如图2所示，18S rRNA基因组仅于407 bp位置存在单一条带，COWP基因组同样仅于430 bp位置存在单一条带。大肠埃希菌、牛艾美尔球虫、弓形虫、微小隐孢子虫以及阴性对照均未扩增出条带。

图2 巢式PCR特异性试验Fig.2 Nested PCR specificity testA:18S rRNA基因； B:COWP基因; M:DNA标准DL2000； 1：安氏隐孢子虫； 2：大肠埃希菌； 3：牛艾美尔球虫； 4：弓形虫； 5：微小隐孢子虫； 6：阴性对照A:18S rRNA gene; B:COWP gene； M：DNA Marker DL2 000； 1：Cryptosporidium andersoni； 2：Escherichia coli； 3：Eimel coccidia bovis； 4：Toxoplasma； 5：Cryptosporidium parvum; 6:Negative control

2.2.2 敏感性试验 凝胶电泳结果如图3所示，18S rRNA基因组在24.3 ng/μL、2.43 ng/μL、243pg/μL和24.3pg/μL四个泳道均可看到目的条带，其中24.3 ng/μL条带最清晰，24.3pg/μL能隐约看到条带;COWP基因组和参考的核糖体RNA小亚基(SSU rRNA)基因在24.3 ng/μL、2.43 ng/μL和243pg/μL三个泳道均可看到目的条带，其中24.3 ng/μL条带最清晰，243pg/μL能隐约看到条带。

图3 巢氏PCR敏感性试验Fig.3 Nested PCR sensitivity testA:18S rRNA基因; B:COWP基因; C:SSU rRNA基因； M:DNA标准DL2 000； 1：24.3 ng/μL； 2：2.43 ng/μL； 3：243pg/μL； 4：24.3pg/μL； 5：2.43pg/μL； 6：243fg/μL； 7：阴性对照A:18S rRNA gene; B:COWP gene； C:SSU rRNA gene; M：DNA Marker DL2 000； 1：24.3 ng/μL； 2：2.43 ng/μL； 3：243pg/μL； 4：24.3pg/μL； 5：2.43pg/μL； 6：243fg/μL； 7：Negative control

2.2.3 重复性试验 凝胶电泳结果如图4所示，18S rRNA基因组均能扩增出约为407 bp的目的条带；COWP基因组均能扩增出约为430 bp的目的条带。

图4 巢式PCR重复性试验Fig.4 Nested PCR repeatability testA:18S rRNA基因; B:COWP基因; M:DNA标准DL2 000； 1～3：1号阳性样本； 4～6:2号阳性样本； 7～9:3号阳性样本； 10：阴性对照A:18S rRNA gene; B:COWP gene; M：DNA marker DL2 000； 1-3：Positive sample number 1； 4-6:Positive sample number 2； 7-9:Positive sample number 3； 10：Negative control

2.3 COWP基因巢式PCR检测18S rRNA基因阳性样本 通过建立的18S rRNA基因巢氏PCR方法检测采集的来自华中地区三省部分牛场的粪便样本，总阳性率为32.86%(185/563)，其中河南、湖北和湖南的总隐孢子虫感染率分别为33.54%(53/158)、28.96%(53/183)和37.50%(79/222)，安氏隐孢子虫感染率为83.78%(155/185)，为华中地区隐孢子虫的优势虫种(表2)。运用SPSS 16.0计算18S rRNA基因巢氏PCR检测出的华中地区3个省份阳性率的差异率：P=0.000 1，差异极显著，具有统计学意义。

通过建立的COWP基因巢氏PCR方法检测18S rRNA基因巢氏PCR检测出的185份阳性样本，185份样本中检测为阳性的样本数为148，总阳性率为80.00%，其中河南、湖北和湖南检测出的感染率分别为81.13%、83.02%和77.22%，安氏隐孢子虫感染率为91.89%(136/148)(表2)。运用SPSS 16.0计算COWP基因巢氏PCR检测出的3个省份阳性率的差异率：P=0.000 1，差异极显著，具有统计学意义。

表2 隐孢子虫阳性率Table 2 Positive rate of Cryptosporidium [份(%)]

使用Zhang等[7]建立的巢氏PCR方法检测本试验的全部样本，检测出的阳性样本数为153份，阳性率为27.17%。18S rRNA基因巢氏PCR检测出安氏隐孢子虫阳性率为27.53%，COWP基因巢氏PCR检测出安氏隐孢子虫阳性率为24.16%，本试验建立的2种方法中18S rRNA基因巢氏PCR检测样本阳性率最高。经SPSS 16.0计算分析本试验建立2种巢式PCR检测出的阳性率的差异率：P=0.001,差异极显著，具有统计学意义。

应用18S rRNA基因巢氏PCR对华中地区三省奶牛场的563份奶牛粪便 DNA 样品进行扩增，结果如图5所示，9月份感染率最高，1月份感染率最低；春、夏、秋、冬4个季节安氏隐孢子虫感染率分别为 20.14%、30.11%、36.71%和16.25%，秋季安氏隐孢子虫感染率最高，4个季节感染率存在极显著差异(P=0.006)，具有统计学意义。

图5 隐孢子虫感染情况Fig.5 C. andersoni infectionsA:不同月份感染情况； B:不同季节感染情况A:Infection in different months; B:Infection in different seasons

3 讨论

隐孢子虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，常呈世界性分布，已经被世界卫生组织(WHO)列为人类最常见的6种腹泻病之一。隐孢子虫病目前尚无有效的疫苗和特效的治疗药物，所以早期的诊断对其防控显得尤为重要。因此，本试验建立一种敏感、特异的巢氏PCR检测方法，可用于奶牛隐孢子虫流行病学调查，为防控此病提供科学依据。

采用18S rRNA基因巢氏PCR检测粪便样本，检测出4种隐孢子虫，总阳性率为32.86%，其中微小隐孢子虫阳性率为2.49%，牛隐孢子虫阳性率为2.66%，安氏隐孢子虫阳性率为27.53%，瑞氏隐孢子虫阳性率为0.18%，安氏隐孢子虫阳性率占4种隐孢子虫总阳性率的83.78%。因此，确定安氏隐孢子虫为华中地区的优势虫种。华中三省安氏隐孢子虫感染率为27.53%，与经典巢氏PCR检测的阳性率27.17%相比差异不显著。其中河南、湖北和湖南安氏隐孢子虫感染率分别为27.85%、20.22%和33.33%。

本次调查采样中秋季感染率最高，冬季感染率最低，春夏两季安氏隐孢子虫的感染率差异不显著(P>0.05)，不具有统计学意义；秋季安氏隐孢子虫感染率存在极显著差异(P=0.006)，具有统计学意义。在本次调查中安氏隐孢子虫在9月份感染率最高，1月份感染率最低，这与Marzieh等[8]对爱尔兰采样调查的结果大致相同，这可能与饲养环境有关，夏季和秋季因气候炎热潮湿，圈舍养殖为安氏隐孢子虫的传播造就了有利的条件，冬季由于天气干燥寒冷，不利于安氏隐孢子虫的传播，因此夏季和秋季的安氏隐孢子虫感染率较高。但由于养殖环境变化，还不确定是否夏秋两季感染率最高，需要进一步采样检测加以验证。

目前，分子生物学技术是检测隐孢子虫较为有效的办法[9]，本试验建立的安氏隐孢子虫巢氏PCR检测方法不仅可以增加PCR反应的特异性，同时还能够让反应更加敏感，重复性较好，能够用于临床样本的检测。且本试验建立的18S rRNA基因巢氏PCR的敏感性是COWP基因的10倍，18S rRNA基因巢氏PCR检测更加敏感。