HPLC法测定藏药三果汤中没食子酸、三没食子酰基葡萄糖和五没食子酰基葡萄糖的含量

黄 宽 林艾和 张艳娇 范 源,2*

1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第二附属医院，云南 昆明 650216

藏药三果汤又名哲布汤，由余甘子、诃子、毛诃子组成，是藏药中重要的常见基础方，具有调节“隆”和“血”的功效。三果汤始载于《四部医典》，具有治疗瘟疫、紊乱热症、促使热症成型的作用[1]。传统中医学认为三果汤方中余甘子味甘、酸、涩，归肺、胃经，性凉；诃子味苦、酸、涩，归肺、大肠经，性平；毛诃子味甘、涩，性平。三味药合用具有清热、调和气血的功效。

现代药理学研究表明，三果汤具有抗菌[2]、抗炎[3-4]、抗肿瘤[5-6]、抗氧化[7-8]、降糖[9]、降脂[10]等药理作用。三果汤主要含有鞣质酚酸类成分[11]，没食子酸是鞣质的重要组成成分，其常见的衍生物为1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖和1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖，研究发现没食子酸及其酯类衍生物都具有抗癌药理活性[12-13]。目前研究单味药的化学成分含量及药理活性较为常见，而对三果汤复方研究较少。本研究针对三果汤中没食子酸及其衍生物1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖进行含量测定，为提高藏药三果汤质量控制提供理论基础。

1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，色谱柱为 Agilent Zorbax C18键合硅胶柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；DFY-600摇摆式高速万能粉碎机(永康式速锋工贸有限公司)；T-1000型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO十万分之一分析天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)。

没食子酸(Gallica acid，GA)购自四川省维克奇生物科技有限公司(批号：wkq16081904)、1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖(1,3,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG)购自武汉天植生物技术有限公司(批号：CFS201802)、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖(1,2,3,4,6-O-galloyl-D-glucose，PGG)购自成都普瑞法科技开发有限公司(批号：PRF10011001)；乙腈(色谱纯)，磷酸(分析纯)购自天津市风船化学试剂有限公司；Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱为 Agilent Zorbax C18键合硅胶柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；电子天平(购自北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱条件：色谱柱为Agilent C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脱：0～6 min，4%～8%；6～30 min，8%～20%；30～55 min，20%～40%；检测波长260 nm；柱温：25 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量为10 μL。色谱图如图1所示。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取GA、3GG、PGG对照品3.9 mg、1.3 mg、0.7 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇配制成含GA、3GG、PGG 0.39 mg/mL、0.13 mg/mL、0.07 mg/mL的混合对照品溶液，用0.45 μm的微孔滤膜进行过滤处理，备用。

2.2.2 供试品溶液 取诃子、毛诃子、余甘子药材(去核)各5.0 g，捣碎，加入100 mL馏水，浸泡30 min，煎煮3次，每次20 min，过滤，合并3次滤液，浓缩10 mL的三果汤水提物，吸取水提物1 mL，加50%甲醇定容50 mL容量瓶中，冷藏备用。用0.45 μm的微孔滤膜进行过滤处理，即得到样品溶液。

2.3 线性关系考察 配制不同质量浓度的对照品溶液，在“2.1”项条件下依次连续进样，以质量浓度(mg/mL)为横坐标(X)，峰面积(mAU*s)为纵坐标(Y)进行线性回归，绘制标准曲线，结果见表1，表明各成分均具有良好的线性关系。

表1 线性关系考察结果

2.4 精密度 试验精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，在“2.1”项条件下连续进样6次，结果显示GA、TGG、PGG峰面积RSD分别为1.22%、1.58%、1.01%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项条件下，分别于2、4、6、8、10、12 h进样，结果显示GA、TGG、PGG 10 h内峰面积的RSD值分别为0.77%、1.39%、1.08%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 取同一批三果汤粉末6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样，结果显示GA、TGG、PGG含有量RSD分别为1.18%、0.37%、0.83%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批三果汤粉末6份，每份精密称取5.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，加入GA、TGG、PGG对照品适量(约相当于5.0 g样品中所含GA、3GG和PGG的量)，再按“2.3”项下色谱条件，进样10 μL，进行检测，计算平均回收率。按“2.2.3”项下方法制备供试溶液，在“2.1”项条件下进样。结果见表2。

2.8 含量测定 取3份不同批次余甘子样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下条件下进样，计算四种成分含有量。结果见表3。

表2 加样回收率试验 (n=9)

表3 含量测定结果

3 讨论

三果汤作为传统藏药在临床上应用广泛，且具有良好的临床疗效。鞣质酚酸类化合物是三果汤的主要有效成分，易溶于水，故本研究采用水提的方式处理样品。对比煎煮次数，结果显示，煎煮三次时，含量达到最高。

预实验分别以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作为流动相进行考察，当乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时，采用梯度洗脱，目标峰的色谱图峰拖尾得到改善，且峰形更好，达到更高的分离度，因此选定乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相。另外，还对柱温(25、30、35、40 ℃)和流速(0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min)进行了优化，结果显示，柱温25 ℃、流速0.8 mL/min 时分离效果较佳。

本研究建立同时测定藏药三果汤中没食子酸、1，3，6-O-三没食子酰基葡萄糖、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基葡萄糖含量的高效液相色谱法，供试品制备简便，结果准确，重复性好，专属性高，结果可靠，可为三果汤质量控制提供一定依据。