昆虫普通气味结合蛋白研究进展

张 雪， 黄 聪， 武 强， 杨念婉， 钱万强， 万方浩*

1青岛农业大学植物医学学院，山东 青岛 266109; 2中国农业科学院深圳农业基因组研究所，广东 深圳 518120; 3中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

昆虫是地球上数量最多、种类最丰富的动物类群。多数昆虫在寻找栖境、觅食、交配以及产卵等过程中，依靠嗅觉系统识别外部环境中的各种化学信息物质，包括寄主植物产生的挥发性气味物质(volatile organic compounds, VOCs)和昆虫产生的信息素(pheromone)等，进而引起相应的行为反应(Martinetal.,2011)。昆虫对气味分子的识别主要由位于触角上的嗅觉感器完成，气味分子通过嗅觉感器上的小孔进入感器淋巴腔内，并与水溶性的气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs) 结合，形成气味结合蛋白-气味分子复合体，随后被运送至嗅觉神经元树突膜上的气味受体(olfactory receptor, ORs)或离子型受体(ionotropic receptor, IRs)并使之激活，引起膜电位发生变化并刺激神经，经轴突传到中枢神经系统，大脑整合后发出指令，从而引发相应的嗅觉行为反应(Bentonetal.,2009; Vogt & Riddiford,1981)。其中，OBPs是一类主要存在于触角感器内的小分子量的球状蛋白，具有数量多、水溶性和偏酸性等特点 (Vogtetal.,2002)，在昆虫嗅觉活动中发挥重要作用(Sunetal.,2018; Zwiebel & Takken,2004)。气味分子通过触角感器表面的孔和孔道进入到触角感器淋巴液，然而脂溶性的气味分子不能直接穿过亲水性的淋巴液，此时OBPs承担起运载气味化合物的角色，该过程是昆虫识别环境气味物质的第一步生理反应 (Vogt & Riddiford,1981)，在昆虫与外界进行信息交流活动中具有重要意义(纪萍等,2013; Vosshall & Stensmyr,2005)。

Vogt & Riddiford (1981)利用同位素标记的方法，在多音天蚕Antheraeapolyphemus(Cramer)雄蛾的触角中鉴定出信息素结合蛋白(pheromone binding protein, PBPs)，这是首个被鉴定的OBP家族成员。Breeretal.(1990)研究发现了另一类结合植物源气味的OBPs，并命名为普通气味结合蛋白(general odorant binding proteins, GOBPs) ，其中根据氨基酸序列的差异，GOBPs又分为GOBPs Ⅰ和GOBPs Ⅱ(刘柳,2019; 任珍珍等,2010)。随着研究的深入，科学家们又发现一类触角特异蛋白(antennal specific proteins, ASPs)，这类蛋白最初在西方蜜蜂ApismelliferaL.中发现，包括触角特异蛋白ASP1和ASP2(Dantyetal.,1998)。研究发现，并非所有OBPs都是嗅觉所必需的，如在果蝇Drosophilamelanogaster中，即使在敲除某些感器上的OBPs的情况下，这些感器仍可以对气味作出反应(Xiaoetal.,2019)，但对于鳞翅目昆虫尤其是蛾类昆虫来说，GOBPs在其嗅觉中不可或缺(Huangetal.,2018; Khuhroetal.,2017; Tianetal.,2019)，说明GOBPs在鳞翅目蛾类昆虫嗅觉行为中起到至关重要的作用。起初，人们认为 GOBPs只与植物挥发物等普通气味分子结合，然而随着昆虫基因组和转录组测序技术的发展，越来越多的GOBPs被鉴定出来，GOBPs的功能也被深入研究，人们发现，GOBPs不仅可与植物挥发物结合，也能够与性信息素分子发生结合，甚至结合能力高于PBPs(Acinetal.,2009; Gongetal.,2006; Pelosietal.,2006)。本文从GOBPs的分子特征、表达特性、生理功能、进化，以及在害虫防治中的应用等方面进行了综述，以期为GOBPs的功能研究以及GOBPs作为靶标在害虫监测及防治方面提供一些参考建议。

1 GOBPs的分子和结构特征

昆虫GOBPs 的分子质量为16.0～17.2 kD，氨基酸序列在140～150位氨基酸，大部分GOBPs具有N-信号肽 (20个氨基酸左右)，等电点为4.9～5.1(缪森等，2003)；一般都具有6个保守的半胱氨酸 (Cys)，并通过特定的组合方式形成3对二硫键，形成稳定的蛋白结构，且二硫键形成的α螺旋疏水结合腔可以调控普通气味分子的结合与释放，这种6-Cys模式已经成为昆虫OBPs的“典型特征” (Pelosietal.,2014)。研究发现，鳞翅目昆虫GOBPs二级结构大都包含7个α螺旋、2个310-螺旋和2个β转角，二级结构较为相似 (图1) (张升祥等,2010a)；与PBP相比，鳞翅目昆虫不同种同一类型GOBP间有较高的氨基酸相似性，而GOBP1与GOBP2之间则有较低的氨基酸相似性 (50%左右)，但GOBPs和PBPs之间序列一致性更低 (<50%) (刘乃勇,2015)。

明确蛋白质及其复合物的三维结构是从蛋白质分子水平上进行功能研究的前提。X-射线晶体学、核磁共振和冷冻电镜三维重构技术是当前研究蛋白质三维结构的主要技术，昆虫OBPs的三维结构常用X-射线晶体学、核磁共振这2种方法进行解析，Sandleretal.(2000)首次采用X-射线晶体学获得了家蚕BombyxmoriL.与蚕蛾醇bombykol的BmorPBP1-bombykol (pH 8.2) 复合晶体结构 (图2)，随后BmorGOBP2的晶体结构也被解析出来(Zhouetal.,2009)，其三级结构由N-端、α-螺旋、Loop环和C端形成一个疏水性的结合腔 (图1)，这些结构特征与BmorPBP晶体结构类似。目前，鳞翅目、膜翅目、双翅目、直翅目、半翅目、脉翅目、蜚蠊目等多种昆虫OBPs的单体或复合结构已相继被解析出来 (杜亚丽等,2020)。

OBPs的功能与其拓扑结构密切相关，且受pH值的调控，如BmorPBP在pH值较低时，C链末端会额外构成1个α-螺旋，同时占据结合腔的内部，挤出气味分子；当pH值为中性时，C链末端又会变得疏松，此时气味分子可进入结合腔 (Horstetal.,2001; Lealetal.,2005)。与BmorPBP不同，在pH值为中性时，BmorGOBP2的C端形成一个规则的α-螺旋，这个螺旋位于结合腔的表面，不占据结合腔。通过与配体结合测定，以及X-射线晶体衍射分析表明，BmorGOBP2能与性信息素组分蚕蛾醇有较强结合力 (图1)，BmorGOBP2中的精氨酸残基 (Arg110) 和蚕蛾醇形成氢键，而BmorPBP则是丝氨酸残基 (Ser56) 参与氢键的形成 (Zhouetal.,2009)。这表明GOBPs与PBPs具有相似的三维结构特征，但在与配体结合过程中，两者在结构变化方面存在差异。

图1 家蚕BmorGOBP2-bombykol晶体结构示意图 (修改自Zhou et al.,2009)

图2 家蚕BmorPBP-bombykol晶体结构示意图 (修改自Sandler et al.,2000)

2 GOBPs的表达特性

2.1 GOBPs在不同组织中的表达

昆虫的OBPs主要存在于触角感器中，而位于不同类型感器中的OBPs与其功能分化有关。感受信息素的PBPs主要位于毛形感器上；而感受普通气味分子的GOBPs主要位于锥形感器上(Sunetal.,2019; Wangetal.,2020)，其中，GOBP1多存在于毛形和锥形感器，而GOBP2主要存在于锥形感器内(Steinbrecht,1996; Zhangetal.,2001)，但在雌蛾的毛形感器内，2种GOBPs均存在(Laueetal.,1994)。此外，也有研究表明昆虫的GOBPs表达于头部的其他附属器官，如下唇须和下颚须，以及足、外生殖器、腹部等组织。然而，昆虫的GOBPs在上述不同组织中的表达存在差异，如沙棘木蠹蛾Eogystiahippophaecolus(Hua, Chou, Fang et Chen)雄成虫的EhipGOBP1与EhipGOBP2在触角中表达最高，下唇须次之，足与外生殖器表达量相当(刘柳,2019; Huetal.,2016)；苹果蠹蛾Cydiapomonella(L.)的CpomGOBP2和CpomGOBP3除在触角中表达外，在口器、雌性成虫的腹部末端也有明显表达(Garczynskietal.,2013)；斜纹夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)的SlitGOBP2在雌、雄虫触角中的表达水平均最高，在身体其他部位如足、翅膀、口器中也有分布 (郭晓洁等,2018)。由于OBPs表达量高低与其功能密切相关，因此，这些在不同组织中差异表达的GOBPs预示着具有不同的生理功能，如沙棘木蠹蛾的EhipGOBP1在外生殖器中表达，表明它们可能参与性信息素的释放(刘柳,2019; Lietal.,2020)；斜纹夜蛾的SlitGOBP2雄虫各部位的表达量除触角和中足外，均低于雌虫相应部位的表达量，暗示雌虫SlitGOBP2蛋白可能还具有感受其他特殊信息素的功能 (郭晓洁等,2018)；小地老虎Agrotisipsilon(Hufnagel)的AipsGOBP1 和AipsGOBP2在触角中高表达，实验证实这2个基因能同时结合其信息素和寄主植物挥发物成分(Huangetal.,2018)。

2.2 GOBPs的性别差异表达

GOBPs一般在雌性昆虫触角中的表达量较高(Laueetal.,1994; Steinbrechtetal.,1995)。然而，不同科的鳞翅目昆虫GOBPs在两性触角中的表达模式存在差异(刘乃勇,2015)。夜蛾科昆虫的2个GOBPs主要偏雌性高表达，如小地老虎的AipsGOBP1和AipsGOBP2在雌性触角中的表达量比雄性中更高(黄广振,2019)；棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)的2个HarmGOBPs也均表现为雌性触角高表达(Zhangetal.,2011)。然而，非夜蛾科昆虫的GOBPs在两性间的表达偏好性比较多样，而且在不同种间的GOBPs的表达也具有不同的性偏好特性。如梨小食心虫Grapholithamolesta(Busck)的GmolGOBP1在雄性触角中表达高于雌性，而GmolGOBP2在雌性触角中表达高于雄性 (Zhangetal.,2012)；桃小食心虫CarposinasasakiiMatsumura的CsasGOBP1在雄虫触角中的表达量显著高于雌虫，但CsasGOBP2在雌性触角中的表达量更高(Tianetal.,2019)；荔枝蒂蛀虫ConopomorphasinensisBradley的CsinGOBP1在雌雄触角表达量相似，而CsinGOBP2具有雄性偏向表达，雄性触角的转录水平是雌性的2倍以上(Yaoetal.,2016)。

2.3 GOBPs在不同发育阶段的表达

GOBPs的表达与昆虫的虫态、成虫日龄等不同发育状态有关。如斜纹夜蛾SlitGOBP2在1～4龄幼虫和蛹后期均有表达，且在1龄幼虫和蛹后期表达量相对较高，而在卵期、5龄和6龄幼虫期等取食量相对较少的时期基本不表达(郭晓洁等,2018)，这可能暗示着SlitGOBP2蛋白可能参与其寻找产卵场所、取食和寄主定位等生命活动。雌性大螟Sesamiainferens(Walker)随着成虫日龄的增加，2个普通气味结合蛋白SinfGOBP1和SinfGOBP2的表达量上调(金俊彦等,2014)；家蚕成虫期时BmorGOBP1和BmorGOBP2在触角的表达量大于在蛹期时触角中的表达量(张升祥等,2010a)；小地老虎的AipsGOBP1和AipsGOBP2都是在成虫羽化前的第3天开始表达，且分别在羽化后第3天和第4天表达达到最高水平(黄广振,2019)。因此，昆虫处于不同的发育时期，其对取食、寄主定位和产卵等方面的需求不同，GOBPs的表达也不尽相同。

此外，昆虫在不同的生理状态下GOBPs的表达量也不尽相同。如交配后的小地老虎AipsGOBP1和AipsGOBP2在雌性触角中的表达量上调，但在雄性触角中的表达量却下调。光照对昆虫GOBP表达量也会产生一定影响，如梨小食心虫在光周期中一直能被检测到表达GmolGOBP1和GmolGOBP2，在整个光周期中，GmolGOBP1的表达量在雄性中一直高于雌性；在光照前期，GmolGOBP2的表达量雄性高于雌性，但在暗期和光期末期，其表达量发生了明显变化，表现为雌性高于雄性(Zhangetal.,2012)。综上，昆虫GOBPs的表达会受到昆虫生命活动以及外界环境的影响而改变，这种随着昆虫发育阶段和生理状态的变化而改变，使得昆虫能够更好地适应环境以及自身生理状态的改变。

3 GOBPs的生理功能

昆虫的GOBPs在与植物化学信号物质的结合中起着主要作用，通过对多种鳞翅目昆虫GOBPs的功能研究，发现其主要识别寄主植物挥发物。如豆荚螟Marucavitrata(Fabricius) MvitGOBP1和MvitGOBP2与丁酸丁酯、柠檬烯等17种植物挥发性气味分子都具有亲和力(Zhouetal.,2015)；草地螟Loxostegesticticalis(L.)的 LstiGOBP2能够与α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、1-己醇和1-庚醇等强烈结合(Yinetal.,2012)；甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)的SexiGOBP1和SexiGOBP2都能与β-紫罗兰酮和亚油酸有很好的结合，且 SexiGOBP2 与植物挥发物金合欢醇、橙花叔醇、油酸等的结合能力较强(Liuetal.,2014)；斜纹夜蛾的SlitGOBP2与橙花叔醇、金合欢烯、油酸和 2-十五烷酮等气味挥发物结合能力较强(Liuetal.,2015)。

在OBPs研究初期，人们认为昆虫GOBPs和PBPs分别结合寄主植物挥发物和性信息素，随着研究进一步深入，人们发现它们的功能界限并没有那么明显，PBPs也可以与普通的植物气味挥发物结合，GOBPs不仅能与寄主植物挥发物特异性结合，而且能够与昆虫的性信息素高度结合。如在家蚕中，BmorGOBP2不仅能结合寄主植物挥发物，还能与BmorPBP1发挥同样的功能，与性信息素蚕蛾醇有较强的结合能力 (图1)(Heetal.,2010)；二化螟Chilosuppressalis(Walker)的CsupGOBP1对2种寄主植物挥发物 (金合欢醇和油酸) 有高结合能力，CsupGOBP2对5种挥发物 ((+)-雪松醇、金合欢醇、香叶烯、β-紫罗兰酮和亚油酸)有较强结合力，而CsupGOBP1和CsupGOBP2都能与3种主要性信息素顺-11-十六碳烯醛(Z11-16:Ald)、顺-9-十六碳烯醛(Z9-16:Ald) 和顺-13-十八碳烯醛(Z13-18:Ald) 高度结合(Khuhroetal.,2017)；甜菜夜蛾的SexiGOBP2与5种性信息素的结合能力比SexiPBP1与性信息素的结合更强 (Liuetal.,2014)；脐橙螟Amyeloistransitella(Walker)的AtraGOBP2与性信息素的主要成分顺，顺-11,13-十六碳二烯醛(Z11Z13-16Ald) 有较强的结合能力，其亲和力可与信息素结合蛋白AtraPBP1相媲美(Liuetal.,2010)。可见，GOBPs在不同的昆虫中可能执行不同的功能，但总体上 GOBPs 不仅在昆虫识别寄主挥发物的过程中发挥着重要的作用，在性信息素的识别中也发挥着重要的作用，此外，昆虫GOBPs是否具有其他功能还有待进一步挖掘。

4 GOBPs的进化起源、扩增与丢失

4.1 GOBPs的进化起源

GOBPs与PBPs位于染色体相邻位置，通过一定的顺序排列形成了鳞翅目昆虫的一个特异的GOBPs/PBPs亚家族基因簇，研究发现，家蚕的GOBPs/PBPs亚家族基因簇中的基因相似度很高，推测可能是来自同一祖先基因复制的结果(张升祥等,2010b; Zhouetal.,2009)。研究者对鳞翅目昆虫GOBPs/PBPs亚家族基因簇中的基因在染色体上的位置关系进行研究时发现，GOBP1距离其他PBPs/GOBPs较远，而GOBP2与PBPs彼此临近，位于同一条染色体上(图3)，说明这些基因可能起源于一个共同的祖先或由它们中的一个基因复制而来，但目前的研究仍未明确具体的起源方式。在烟草天蛾Manducasexta(L.)(Vogtetal.,2015)、家蚕(Gongetal.,2009)、小菜蛾Plutellaxylostella(L.)(Youetal.,2013) 等鳞翅目昆虫中都存在这种现象，这也说明一些鳞翅目昆虫的GOBP2与PBP能够发生协同作用，在信息素识别中发挥重要功能。

图3 鳞翅目昆虫典型的GOBPs/PBPs亚家族基因簇在染色体上的排列位置示意图(修改自Yasukochi et al.,2018)

4.2 GOBPs/PBPs基因簇基因的扩增与丢失

研究发现，GOBPs/PBPs基因簇极有可能已经在鳞翅目昆虫的共同祖先双孔亚目中发生了分化，尽管昆虫GOBPs经常出现谱系特异性的得失以及这些基因与邻近基因的倒位和易位现象，但基因的数量和顺序是基本保守的。小菜蛾PxylGOBP1和冬尺蠖蛾Operophterabrumata(L.)ObruGOBP1基因发生了拷贝并发生了易位现象 (Yasukochietal.,2018)，苹果蠹蛾CpomGOBP基因发生了拷贝现象，发现了3个CpomGOBP基因(Garczynskietal.,2013)。然而在目前已有研究中GOBP基因的拷贝、易位现象只在这几个物种中被观察到，不具有普遍性，说明GOBPs基因还是相对保守的。

相对于GOBPs，鳞翅目昆虫的PBPs基因更易发生丢失现象，这可能与GOBPs基因的功能多元化有关，逐渐取代了PBP基因的功能。研究表明，PBP-B基因在蛾类和蝶类昆虫中均易发生广泛的缺失现象，如草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(JE Smith)、粉纹夜蛾Trichoplusiani(Hübner)、诗神袖蝶Heliconiusmelpomene(L.)、暗脉菜粉蝶Pierisnapi(L.)都发生了PBP-B基因的缺失现象(Yasukochietal.,2018)，意味着PBP-B基因的缺失并不一定会降低昆虫的适应度。而相对于蛾类来说，蝶类的PBP-A基因更易发生丢失现象，如帝王蝶Danausplexippus(L.)、诗神袖蝶、暗脉菜粉蝶等蝶类均发生了PBP-A基因的丢失现象，仅在弄蝶科的Leremaaccius(Smith)和凤蝶科的柑橘凤蝶PapilioxuthusL.中发现PBP-A基因的存在，而在柑橘凤蝶中PBP-A基因位于远离GOBPs/PBPs基因簇的位置，这增加了其不再作为信息素结合蛋白发挥作用的可能性(Yasukochietal.,2018)。推测主要原因是在长期的进化过程中，蝶类主要在白天进行活动，而蛾类主要在夜晚进行活动，导致蝶类的视觉不断进化，在两性交配过程中原来嗅觉发挥的主导作用在进化中偏向了视觉，而PBP-A主要作用为识别性信息素，以供雄虫快速寻找雌虫进行交配，在蝶类视觉的进化过程中，逐渐发生了丢失现象。因此，推测不同物种中GOBPs/PBPs基因簇中基因的拷贝、丢失、易位等现象 (图4) 极可能与物种间的GOBPs/PBPs功能分化有关。

5 GOBPs在害虫监测和防治方面的应用前景

由于OBPs具有多元化、稳定、易通过重组方式获得，以及配体选择等特性，昆虫OBPs在研制生物传感器或电子鼻等领域越来越受到关注(Barbosaetal.,2018; Caveetal.,2019; Pelosietal.,2018)。如Dimitratosetal.(2019)利用冈比亚按蚊AnophelesgambiaeGiles的AgamOBP1 与大肠杆菌Escherichiacoli代谢物吲哚特异结合的特性，开发了一种体外高敏度检测水中大肠杆菌的生物传感器。Luetal.(2015)基于橘小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)的气味结合蛋白BdorOBP2和交叉电极开发出了可高灵敏度检测乙酸异戊酯、叶茄酮和苯甲醛的传感器。Larisikaetal. (2015)基于意大利蜜蜂ApismelliferaligusticaSpinola的气味结合蛋白AmelOBP14设计了一种嗅觉生物传感器，用于实时监测对蜜蜂有吸引力的各种气味物质。基于棉铃虫的气味结合蛋白HarmOBP7来源的短肽链HarmOBPP4开发的生物传感器能够准确识别辛醛、乙醛，以及苯甲醛(Wasilewskietal.,2019)。

OBPs基因在与气味分子的结合及传递过程中起着至关重要的作用，决定了昆虫对化学信号刺激一定程度的响应，因此，功能性OBPs可以作为筛选昆虫引诱剂或趋避剂的分子靶点。研究表明，OBPs与气味分子的结合取决于它们的三维结构及构象，同一OBP可与一类结构和理化性质相似的气味化合物结合(Liuetal.,2019; Santanaetal.,2018)。基于此，科学家们提出了计算反向化学生态学的概念，基于OBPs基因的结构和功能之间的关系，利用同源建模和分子对接等技术手段和方法，通过计算机快速准确筛选配体小分子，达到以OBPs基因为靶标的害虫防治目的(Venthur & Zhou,2018)，并成功应用于筛选昆虫行为调节剂的活性化合物。如以致倦库蚊CulexquinquefasciatusSay气味结合蛋白CquiOBP1为分子靶标，筛选与其结合能力较强的非天然配体，成功地筛选出以一定比例混合的壬醛、三甲胺组分，并已实现商品化产卵引诱剂(Lealetal.,2008)。研究发现，豌豆蚜AcyrthosiphonpisumHarris ApisOBP3 结合报警信息素(E)-β-法尼烯(EBF)(Qiaoetal.,2009)，后来通过EBF与 ApisOBP3 配体识别区域的基团与噻虫啉的杀虫基团融合，成功地合成了对蚜虫具有驱避和杀虫双重作用的化合物(Sunetal.,2011)。这种基于计算反向化学生态学的理论，通过计算机模拟的方法，重构OBPs的三维结构模型并通过分子对接的方法来筛选气味化合物，与之前的传统化学生态学中利用试错筛选方法相比，大大减少了气味候选化合物的数量，缩短筛选周期并降低了筛选成本。目前GOBPs在害虫防治中的应用尚未有明确报道，但GOBPs是鳞翅目昆虫气味结合蛋白中的重要亚家族，相信GOBPs将是害虫防治的一个重要靶点。

图4 鳞翅目昆虫GOBP/PBP系统发育树 (修改自Vogt et al.,2015)

6 小结与展望

近年来，昆虫嗅觉领域的研究取得了显著进展，特别是对于较早发现的PBPs研究较为深入，但对于GOBPs的研究相对较少。而GOBPs的分子特征、结构、生理功能、进化等方面仍然是昆虫嗅觉发展中的关键问题，对GOBPs的研究不仅能够促进人们对昆虫与植物化学通讯等生态学问题有更深入的理解，进一步揭示昆虫的化学感受机制，也可以为研制昆虫引诱剂、趋避剂等绿色高效的防治产品提供更多思路。基于GOBPs结构和功能之间的关系，利用“计算反向化学生态学”的理念，通过同源建模和分子对接等计算机技术来进行高通量筛选与OBPs结合的最佳配体的方法越来越受到研究者们的青睐，可为害虫的高效绿色防治技术的发展提供可靠依据。除在嗅觉方面发挥功能以外，GOBPs也可在生物传感器和电子鼻等研发领域展现优势，利用GOBPs与害虫信息素结合的特点，发展出特异识别害虫的电子鼻等，可用于害虫或入侵物种的监测以及为进出境检验检疫提供新思路和新技术，值得人们进一步研究(Caveetal.,2019)。