杏褪绿卷叶植原体新疆分离物核糖体蛋白基因的克隆与序列分析

韩 剑， 陈 杭， 艾克热木·买买提， 罗 明， 唐章虎

1新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052； 2新疆自治区高校农林有害生物监测与安全防控重点实验室，新疆 乌鲁木齐830052； 3新疆农业科学院轮台国家果树资源圃，新疆 轮台 841600

由于植原体至今无法分离培养，难以采用纯培养的表型特征分类鉴定，主要依据其基因组核酸序列和分子特征进行系统发育关系分析。16S rDNA基因是植原体分类体系中的首选分子标记，但大量研究表明，16S rDNA序列过于保守，不足以对于亲缘关系较近的植原体作进一步划分(Duduketal.,2008)。核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因是植原体进化演变过程中一个重要的基因，其在植原体株系间关系以及系统发育的研究中能够揭示更多有价值信息以及系统发育的标记，能用于16S rDNA基因不易被区分的近缘株系的分类研究。Leeetal. (2000)通过16S rDNA和rp基因相结合的RFLP分析，将当时的植原体株系详尽地划分为19个组46个亚组。Martinietal.(2002)基于rp基因进行系统发育研究，将榆树黄化组(16SrV)划分为12个rpV亚组，表明rp基因在划分亲缘关系更近的植原体株系中是一个有效的分子标记。在我国，蔡红等(2003)首次报道了长春花黄化植原体的rp基因，并将其用于植原体系统分类研究。随后，利用rp基因序列对枣疯病植原体(王利平等,2014)、泡桐丛枝病植原体(和志娇等,2014)、花生丛枝植原体(万琼莲等,2014)等进行系统分类的研究也陆续被报道。目前，国内尚未见关于杏褪绿卷叶植原体rp基因的研究报道。本研究对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因进行克隆和序列分析，以期获取其分子特征信息，分析其分子变异，在亚组水平上确定其分类地位。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试样品：2018—2019年在新疆轮台县和托克逊县采集表现为叶片上卷、叶肉有不规则褪绿的疑似杏褪绿卷叶病样品112份，将采集的叶片、枝条组织保存于保鲜袋内，带回实验室后保存于4和-20 ℃冰箱中。经植原体16S rDNA检测，有54份样品确定为感病样品。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、标准分子量Marker购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆载体pMDTM19T以及其他酶类等分子生物学试剂均购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.2 方法

1.2.1 杏树枝条韧皮部总DNA的提取 采用CTAB法(Greenetal.,1999)，提取杏树多年生枝条韧皮部总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量后，置于-40 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2rp基因的PCR扩增 参照Leeetal.(1998)报道的植原体rp基因引物对序列进行PCR扩增：rpF1(5′-GGAGTAAGGTGAATTT-3′)，rpR1(5′-ACGTATTTACTTTTTGG-3′)。PCR扩增反应体系(25 μL)：DNA模板2.0 μL， 10 μmol·L-1rpF1/rpF2各1.0 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1.5 μL，10×PCR Buffer(2.5 mmol·L-1MgCl2) 2.5 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.5 μL，补足灭菌超纯水至25 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，51 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取PCR扩增产物在添加Goldview染料的琼脂糖(浓度为10 g·L-1)中进行电泳(1×TAE缓冲系统)，使用凝胶成像系统观察并保存拍摄图片。

1.2.3 PCR产物的回收及克隆 将PCR产物中的特异性条带切下，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，纯化。回收的PCR产物与载体pMDTM19T在16 ℃下连接2 h。将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，在含有X-gal (20 g·L-1)、IPTG (50 g·L-1)、Amp (100 mg·L-1)的LB琼脂平板上37 ℃培养14～16 h，形成单菌落。将筛选出的阳性单菌落接种于含Amp (100 mg·L-1) LB液体培养基中，在37 ℃培养过夜，提取质粒，用rpF1/rpR1进行PCR扩增、酶切鉴定。

1.2.4 序列测定与分析 随机选取4个含有目的片段的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。将所得序列在NCBI数据库(https: ∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行BLAST检索，通过DNAstar 软件将所得rp基因序列进行相似性比较，利用MEGA 5.0软件分析，邻接法构建系统进化发育树，同时利用pDWAR 32软件模拟实验室的7种限制性内切酶(AluⅠ、DraⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、MseⅠ、SspⅠ、TaqⅠ)对本研究获得的杏褪绿卷叶植原体和已报道的16SrV-rp亚组参考株系(Martinietal.,2007)的rp基因序列(rpF1/rpR1扩增片段)片段进行RFLP虚拟酶切分析。

2 结果与分析

2.1 新疆杏褪绿卷叶病危害现状及症状特点

本研究于2017—2019年连续3年对新疆轮台县、托克逊县等杏树生产区杏褪绿卷叶病发生情况进行调查。发现该病害有范围扩大、加重的趋势，目前在新疆轮台县、托克逊县、乌鲁木齐市周边均发现疑似病株，通过分子检测和嫁接传病试验确定为植原体病原。部分杏园的发病率已超过30%，患病果园减产可达20%～50%，严重影响杏果品质。调查发现，不同地区、不同品种的杏树中表现的症状基本相似，表现为叶片边缘沿叶脉向上卷。发病初期，感病植株的部分叶片会呈现卷叶症状，严重的整株叶片卷成筒状呈失水状，叶片表面呈现不规则的褪绿现象。发病植株果实的生长发育受到抑制，果实成熟期推迟，品质变劣，产量严重下降，并伴有落叶落果现象。发病植株随着发病年数的增长，病情逐渐加深，直至整株干枯、死亡(图1)。

图1 新疆杏褪绿卷叶病症状图

2.2 杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因PCR扩增结果

以54份杏褪绿卷叶病阳性样品总DNA为模板，利用引物rpF1/rpR1对植原体rp基因进行PCR扩增，电泳结果表明，部分样品获得了约1.2 kb的特异性条带，同时，枣疯病植原体也扩增出相同的特异性条带，而健康植株和灭菌超纯水均未出现特异性条带(图2)。结果表明，所用引物对具有特异性，可从病样中扩增到与目的基因片段大小相符的条带。

2.3 新疆杏褪绿卷叶植原体rp基因的克隆及序列分析

随机选取4个杏褪绿卷叶病病样(轮台县和托克逊县病样各2个)的PCR扩增产物进行回收、纯化、克隆，提取质粒、酶切鉴定，选取阳性克隆进行测序。测序结果表明，新疆杏褪绿卷叶植原体核糖体蛋白基因片段长1196 bp，G+C含量为27.26%，包含部分rpS19基因以及完整的rpL22基因和rpS3基因。其中，rpL22基因以ATG为起始密码子，由354个核苷酸组成的开放阅读框编码117个氨基酸；rpS3基因以ATG为起始密码子，由753个核苷酸组成的开放阅读框编码250个氨基酸，在所含的3个基因中均以TAA作为终止密码子，这些特性均与其他植原体核糖体蛋白基因序列相似。分别命名为ACLR-XJ01～ACLR-XJ04，登录号分别为(MW366827～MW366830)。

将杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的rp基因核苷酸序列在GenBank中经BLAST比对检索，并利用DNAstar软件对核苷酸及氨基酸序列进行相似性比较。结果表明，杏褪绿卷叶植原体新疆分离物ACLR-XJ01～ACLR-XJ04rp基因片段核苷酸序列无差异，相似性达到100%。杏褪绿卷叶植原体新疆分离物ACLR-XJ01～ACLR-XJ04与16SrⅤ-rp亚组各代表性植原体的rp基因核苷酸序列相似性达到95.7%～99.3%，其中与16SrⅤ组rpⅤ-C亚组的甜樱桃绿化植原体SCV-JN-2013 (MF848954)和枣疯病植原体分离物JWB(AY197681)、JWB-Zhangqiu(FJ154856)的亲缘关系最近，序列相似性分别达到99.3%和99.2%，rpL22和rpS3基因编码的氨基酸相似性分别达到98.3%和98.4%(表1)。

图2 杏褪绿卷叶植原体rp基因PCR扩增结果

表1 杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与其他植原体rp基因核苷酸和氨基酸同源性比较

2.4 系统进化及RFLP虚拟分析

将获得的杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因序列与16SrV组及其他组代表性植原体rp基因序列进行比较，共同构建系统进化树。结果表明，杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与16SrV-rp亚组各株系聚在同一个大分支上，其中与rpV-C亚组的甜樱桃绿化植原体SCV-JN-2013 (MF848954)和枣疯病植原体分离物JWB(AY197681)、JWB-Zhangqiu(FJ154856)的亲缘关系最近，聚为单独的一个分支(图3)。进一步利用pDRAW 32软件对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物ACLR-XJ01和16SrV组中12个rpV亚组代表性分离物的rp基因序列(rpF1/rpR1扩增片段)进行AluⅠ等7种限制性内切酶的虚拟RFLP分析，结果显示，杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因的虚拟酶切图谱不同于所有已建立的rpⅤ亚组参考模型，其中与rpV-C亚组(AY197681)相似性最高，但在MseⅠ、SspⅠ和TaqⅠ的酶切位点存在差异(图4)，因此，推测杏褪绿卷叶植原体新疆分离物可能是16SrⅤ组中的一个新的rp亚组。

图3 用邻接法构建的杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因系统发育树

图4 杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与rpⅤ-C亚组代表性植原体rp基因虚拟RFLP酶切图谱

3 讨论

新疆作为杏的原生起源中心，拥有丰富的杏种质资源，栽培面积和产量均居全国各省(区) 之首，形成了环塔克拉玛干大沙漠独特的杏生态品种群和杏产业带。发展杏产业对于地处极端干旱荒漠区、生态环境极为脆弱的南疆地区的防风固沙、生态环境保护和地区经济发展都有着重要的意义。笔者于2016—2019年连续4年对新疆轮台县、托克逊县杏褪绿卷叶病发生情况进行调查，发现该病害从零星、局部发生到范围迅速扩大、加重，表明新疆的地理气候环境适宜该病害的发生，目前该病原极有可能已成功定殖并逐渐进入流行期，给近年来蓬勃发展的新疆经济支柱林果产业带来巨大隐患。本研究首次获取了杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因分子信息，从亚组水平上确定了其分类地位和遗传变异，为研究杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的来源、进化关系，建立杏褪绿卷叶植原体快速诊断和检测技术奠定了基础。

韩冰(2012)首次对新疆轮台县杏褪绿卷病植原体16S rDNA进行PCR扩增、测序和序列分析，结果显示，杏褪绿卷叶植原体新疆分离物16S rDNA基因与16SrV-B亚组枣疯病植原体的同源性最高达到99.8%以上，仅有1～2个碱基的差异。艾克热木·买买提等(2020)验证了杏褪绿卷叶植原体新疆分离物16S rDNA基因序列的同源性，发现与韩冰已报道的杏褪绿卷叶植原体新疆分离物亲缘关系很近，同源性达到99.6%，与16SrV-B亚组的枣疯病植原体山东分离株、甜樱桃绿化植原体山东分离株同源性最高,达到99.4%～99.6%，同样未能在分子水平上体现出不同株系间的差异。这说明植原体在长期的进化过程中16S rDNA基因十分保守，并不适合亲缘关系较近的植原体株系的分类。在植原体株系关系和系统发育研究中发现rp基因能够揭示出更多有价值的信息和系统发育的标记。Martinietal. (2007)对植原体各代表株系进行系统进化分析，结果显示翠菊黄化组(16SrI组)和榆树黄化组(16SrⅤ组)不同亚组间16S rDNA的序列相似性为98.4%～99.2%和98.6%～99.5%，rp基因的相似性为96.8%～98.2%和96.5%～98.1%，说明植原体rp基因较16S rDNA基因具有更大的变异性，更适合用于同一组内亲缘关系更近的株系间的分类。本研究通过对杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因的同源性分析发现，杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与16SrV组(rpV-C)亚组的樱桃绿化植原体和枣疯病植原体亲缘关系最近，核苷酸相似性达到99.2%～99.3%，在系统发育树上聚为一簇，并未表现出明显的遗传分化。但进一步利用RFLP虚拟酶切分析发现，杏褪绿卷叶植原新疆分离物rp基因的酶切图谱与已报到的12个rpV亚组代表性分离物之间均存在一定的差异，尽管与rpⅤ-C亚组代表性植原体的酶切图谱最为相似，但在限制性内切酶MseⅠ、SspⅠ和TaqⅠ的酶切位点上也存在明显差异，因此推测杏褪绿卷叶植原体新疆分离物属于榆树黄化组(16SrV)的一个新rpV亚组。该结果不但证明了rp基因更适合亲缘关系较近的植原体株系的分类，同时也表明RFLP分析更能有效地揭示植原体DNA水平上的遗传多样性。

杏褪绿卷叶病于1973年首次在法国杏树上被发现，之后陆续在欧洲多国相继发生，在亚洲国家土耳其、伊朗、黎巴嫩也有报道。研究发现,尽管不同国家所报道的杏褪绿卷叶病症状相似，但所鉴定的ACLR病原在分类地位上差异显著。如捷克、比利时、土耳其、白俄罗斯等国发生的ACLR病原被鉴定为16SrX-B亚组植原体(Navratiletal.,2001; Olivieretal.,2003; Sertkayaetal.,2005; Valasevichetal.,2016)；德国、黎巴嫩发生的ACLR病原被鉴定为16SrI-F亚组植原体(Abou-jawdaetal.,2011; Hodgettetal.,2008)；伊朗发生的ACLR病原被鉴定为16SrⅡ-C亚组植原体(Rasoulpouretal.,2019)；而本研究发现引起新疆杏褪绿卷叶病的植原体在系统分类上应归于16SrⅤ组。由此可见，杏树可被多种植原体侵染并引起相似的症状，不同分类地位的植原体在杏树上为何能够引起相似的症状，其致病机制如何，还有待深入的研究。